神经细胞凋亡在脊髓缺血再灌注损伤延迟性瘫痪中的作用
作者：马巍，刘碧波，刘淼，王多宁，党胜利
【摘要】 目的 研究细胞凋亡在脊髓缺血再灌注损伤发生延迟性瘫痪中的作用。方法 将48只新西兰白兔随机分为2组：对照组(sham)和缺血再灌注组(IR)。参照并改进Zivin方法建立兔脊髓腰骶段缺血再灌注延迟性瘫痪模型，比较各组动物不同时间点后肢运动功能及病理形态学变化；采用原位末端脱氧核糖核酸酶转移介导的脱氧尿三磷酸(dUTP)标记法(TUNEL法)检测神经细胞凋亡水平。结果 HE染色显示，再灌注8h组神经细胞形态基本正常，结构清楚，灰质中有少量空泡，但神经元细胞结构完好；再灌注24h组：灰质中前角神经元细胞破坏严重，空泡形成，无明显炎症细胞浸润；再灌注72h组：灰质前角中大量空泡形成，尚残存数个结构清楚的运动神经元，有明显炎症细胞浸润；再灌注168h组：灰质中运动神经元消失，残存数个固缩坏死神经元。TUNEL法染色显示，sham组及再灌注8h后，仅见非特异性染色。再灌注24h后出现大量阳性细胞，至再灌注72h阳性细胞数量达到最高峰，主要分布在前角运动神经元。再灌注1周后，灰质结构破坏严重，仅有少量神经元幸存，但其阳性细胞平均积分吸光度值仍较对照组高。结论 脊髓缺血再灌注后发生延迟性瘫痪时，神经元死亡的方式主要是细胞凋亡。
【关键词】 脊髓缺血再灌注损伤；延迟性瘫痪；细胞凋亡
Apoptosis of motor neurons in the spinal cord after ischemia reperfusion injury delayed paraplegia in rabbits
ABSTRACT: Objective To investigate neural cell apoptosis after spinal cord ischemia?reperfusion injury delayed paraplegia in rabbits. Methods The infrarenal aorta of white New Zealand rabbits (n=48) was occluded for 26 minutes using two bulldog clamps. The rabbits were killed after 8, 24, 72, or 168 hours (n=6 for each group). The clamps was placed but never clamped in sham?operated rabbits (n=24). The lumbar segment of the spinal cord (L5 to L7) was used for morphological studies, including hematoxylin and eosin staining and a modified terminal deoxynucleotidyltransferase mediated dUTP biotin nick end?labeling (TUNEL) staining method. Results Delayed paraplegia occurred in all the rabbits of ischemia reperfusion group at 16-24h, but not in sham groups. Motor neurons were selectively lost at 7 days after transient ischemia. After ischemia, the affected areas contained neurons with positive TUNEL staining. Positive neurons were mainly located in gray, although most were concentrated in the intermediate and ventral areas. Adjacent sections were stained with hematoxylin and eosin exhibited ischemic cell changes (red and ghost neurons), while apoptotic bodies were also apparent. In addition, TUNEL study demonstrated that no cells were positively labeled until 24 hours after ischemia, but nuclei of some motor neurons were positively labeled at peak after ischemia reperfusion at 72 hours. Conclusion Spinal cord ischemia in rabbits induces morphological and biochemical changes suggestive of apoptosis. These data raise the possibility that apoptosis contributes to neuronal cell death after spinal cord ischemia.
KEY WORDS: spinal cord ischemia reperfusion injury; delayed paraplegia; apoptosis
脊髓损伤是人类严重致残和死亡的重要原因。缺血性脊髓损伤是多种损伤疾患的后遗症，如胸腹主动脉瘤手术可能发生因脊髓缺血所致的截瘫，其发病率高达30%[1]；脊柱脊髓手术时常遇到难以解释的问题，如脊髓解剖血管丰富的部位T7?9，术中并未波及脊髓，术后有时却出现不明原因的脊髓损伤；腰椎管减压术后亦出现术后症状逐渐加重现象；颈腰椎间盘摘除术中并未损伤脊髓及供应脊髓的血管，但部分患者症状改善后会再次出现脊髓损伤症状，其机制尚不清楚。本研究旨在建立兔脊髓缺血再灌注损伤后延迟性瘫痪模型的基础上[2]，研究脊髓缺血再灌注损伤后延迟性瘫痪的病理和脊髓神经细胞死亡方式及其临床意义。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组 新西兰白兔48只，体重(2.1±0.25)kg，雌雄不拘。随机均分为对照组(sham组，n=24)和脊髓缺血再灌注组(IR组，n=24)，两组又分为再灌注8h组(IR8组)、24h(IR24组)、72h(IR72组)和168h组(IR168组)，每组各6只。
1.2 动物模型的建立 白兔麻醉后，参照并改进Zivin等[3]方法，建立脊髓缺血再灌注延迟性瘫痪模型。具体方法如下：常规无菌消毒，取腹右肋缘下切口，切口长约2cm，暴露并分离腹主动脉，紧靠右肾动脉分支下方用两枚动脉夹夹闭腹主动脉，缺血26min后松开动脉夹，开放再灌注。缺血时间以夹闭瞬间开始计时，松夹瞬间计时再灌注时间。各组均在术前经耳缘静脉按150u/kg给予肝素。对照组仅暴露腹主动脉，不夹闭。切口分层缝合，每日腹腔内注射青霉素80万单位，连续3d。所有动物均在手术后60min内清醒。
1.3 神经功能的观察 各组分别于术后8、24、72、168h观察其后肢运动功能。兔致伤后参照Jacobs等[4]方法对各组兔后肢运动功能进行评级。具体标准如下：0级，全瘫(针刺无反应)；1级：严重瘫痪，最小功能性运动(肌肉搐动)；2级：能进行功能性运动(受累肢体可负重)，但不能齐足跳动，有共济失调和轻瘫(跛行)；3级：能齐足跳动，但有共济失调和轻瘫；4级：齐足跳动，轻度共济失调和(或)轻瘫(奔跑但不够灵活)；5级：正常。据此以0-3级为截瘫标准，出各组兔的截瘫率。
1.4 石蜡标本的制备 各组于缺血再灌注相应时间后麻醉，然后用生理盐水和多聚甲醛心脏灌注固定脊髓组织，切取L3-L5段脊髓组织，行石蜡包埋切片(4μm)。HE 染色： 切片常规用二甲苯脱蜡, 逐级乙醇漂洗, 苏木素染色, 盐酸乙醇分化、脱水, 中性树胶封片。
1.5 TUNEL原位末端标记 组织切片常规脱蜡后逐级乙醇至复水化，蒸馏水冲洗，胃蛋白酶消化60min，流水冲洗中止反应。组织切片用缓冲液漂洗后滴加标记液50μL，覆盖组织切片，PBS漂洗2次后置内源酶阻断剂，PBS漂洗2min，湿盒内用HRP?avidin点片，PBS洗2次，DAB?H2O2显色10min，流水冲洗后常规脱水，树胶封片。试剂由武汉博士德公司提供，具体操作方法参照试剂盒说明书。
1.6 图像分析 以OLYMPUS BH2显微镜将图像传入电脑，随机选取10个视野，选取同一染色条件不同时相点切片，应用Image?Pro Plus Version 5.1 for Window TM 图像分析系统(Media Cybernetics，Inc，USA)进行图像分析，测定阳性细胞平均积分吸光度(integrated optical density, IOD)。
1.7 统计学处理 采用SPSS 12.0 for Windows统计软件。所有数据以±s表示，计量资料采用方差分析，组间比较采用q检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 后肢运动功能的观察 假手术组兔术后1-7d无明显瘫痪表现，截瘫率为0； 缺血再灌注8h组所有白兔未发生瘫痪；缺血再灌注24h组、72h组和168h组所有白兔出现延迟性瘫痪，截瘫发生在16-24h，平均19.6h，截瘫率为100%(18/18)。所有出现瘫痪的动物，神经功能评分未见明显改善(图1)。
图1 再灌注168h各组白兔后肢运动功能的评分（略）
Fig.1 Motor deficit score in the ischemia reperfusion groups and in the sham group during 168h
2.2 脊髓组织HE染色的病观察 对照组：神经细胞轮廓清晰，胞浆均匀深染，整个组织结构完整、清楚，无中性粒细胞浸润，无出血、水肿(图2A)。缺血再灌注组：再灌注8h组见神经细胞形态基本正常，结构清楚，灰质中有少量空泡，但神经元细胞结构完好(图2B)；再灌注24h组：灰质中前角神经元细胞破坏严重，空泡形成，无明显炎症细胞浸润(图2C)；再灌注72h组：灰质前角中大量空泡形成，尚残存数个结构清楚的运动神经元细胞，有明显炎症细胞浸润(图2D)；再灌注168h组：灰质中运动神经元消失，残存数个固缩坏死神经元，周围有明显炎症反应(图2E)。
图2 脊髓缺血再灌注后不同时间的病理变化（略）
Fig.2 Motor neurons in anterior horn of spinal cord in normal controls (A) and of reperfusion group at 8h (B), 24h (C), 72h (D), 168h (E) after ischemia (HE×100)
2.3 TUNEL的观察 对照组：组织切片标记后清晰显示出脊髓组织的正常结构，灰质和白质易区分，神经元和胶质细胞均蓝染，棕黄色的阳性细胞罕见(图3A)。再灌注8h后，仅见非特异性染色(图3B)；再灌注24h后出现大量阳性细胞(图3C)，至再灌注72h达到最高峰，主要分布在前角运动神经元(图3D)。再灌注1周后，灰质结构破坏严重，仅有少量神经元幸存，但白质中阳性胶质细胞数量增加(图3E)。IOD显示，再灌注组与对照组比较，除再灌注8h无差异外，其余均比对照组高(表1)。
图3 脊髓缺血再灌注后不同时间的神经细胞凋亡（略）
Fig.3 Positive neurons in anterior horn of spinal cord with TUNEL staining in sham group (A) and of reperfusion group at 8h (B), 24h (C), 72h (D), 168h (E) after ischemia (TUNEL×400)
表1 各组不同再灌注时间的积分吸光度（略）
Table 1 IOD values of TUNEL staining changes in the anterior horn of spinal cord
*P<0.05, **P<0.01 vs. sham groups
3 讨论
凋亡的概念是1972年由Kerr等人提出的，它是指细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己主动结束生命的过程。凋亡又称程序性细胞死亡，是有核细胞在一定条件下通过启动自身内部机制，主要是内源性DNA内切酶的激活，而发生的死亡过程，是受基因调控的主动的细胞死亡方式，与坏死有着本质的不同。细胞坏死的形态学特点是膜通透性增加，内质网扩张，线粒体及核肿胀，为细胞膜破裂，溶酶体破坏，内容物外溢，同时引起严重的炎症反应。而细胞凋亡的特征是细胞变圆，胞浆浓缩，内质网泡状扩张，细胞碎裂成多个有包膜的凋亡小体，DNA断裂呈梯状结构。原位末端标记法(TUNEL)是将凋亡特异的末端酶打开DNA的末端缺口，加入特殊着色成份，使其敏感性和特异性极高，这是当前国际上公认的检测细胞凋亡的手段[5]。细胞凋亡和细胞坏死是两种截然不同的过程和生物学现象，在形态学、生物化学代谢改变、分子机制、结局和意义等方面都有本质区别。细胞坏死(necrosis)或说是细胞意外性死亡是由于某些外界因素的影响，诸如物理、化学损伤和生物的侵袭以及高温、低温或营养供应的阻断等造成细胞急速死亡；而细胞凋亡不是一种被动过程，而是一种主动过程，并涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用。细胞凋亡在细胞数量和调控方面起到与有丝分裂相对和互补的作用，是一种主动的、受遗传控制的程序化现象，并受各种生理或病理因素诱发或抑制，以细胞的固缩、染色质浓集、凋亡小体的形成及细胞核DNA变性降解为细胞凋亡的主要形态及生化特征[6]。虽然细胞凋亡与细胞坏死是两种截然不同的细胞死亡方式，但两者之间又不是完全对立的，它们之间存在着量效关系。实验证明，应用低浓度细胞毒药物可诱导细胞凋亡，而当浓度超过一定阈值时则死亡形式转换为细胞坏死。因此，细胞凋亡与细胞坏死是相对的两个概念。目前，已发现在脑、脊髓缺血性和机械性损伤模型中，广泛存在DNA损伤，表现为神经细胞凋亡、DNA片段化、转录水平修复、相关基因表达等。但是，对于脊髓缺血再灌注损伤后发生的延迟性瘫痪目前尚未见到。本实验中，我们主要通过建立脊髓缺血再灌注损伤延迟性瘫痪模型，采用原位末端脱氧核糖核苷酸转移酶介导dUTP标记(TUNEL)等技术，明确神经细胞在发生脊髓缺血再灌注损伤延迟性瘫痪后继发损伤期中的凋亡的时相和空间分布特点。本实验研究证实，脊髓缺血再灌注损伤发生延迟性瘫痪神经细胞死亡的方式主要是神经细胞凋亡，其特征有：缺血再灌注8h时，兔的神经功能评价基本正常，病理学显示，脊髓灰质中仅有部分空泡出现，未见明显神经细胞减少，未见有明显的凋亡细胞；缺血再灌注24h后，兔发生了延迟性瘫痪，病理学显示，脊髓灰质中大量的神经细胞减少，至缺血再灌注72h达到高峰，阳性凋亡细胞增多，但炎症细胞只有少量浸润；至缺血再灌注168h后，病理显示脊髓前角神经细胞大量死亡，周围有明显的炎症细胞浸润，此时表现为细胞坏死。Kiyoshima等[7]研究认为脊髓缺血再灌注损伤尚缺乏证据证实神经细胞发生的死亡方式为凋亡，可能与制作的动物模型方式不同以及缺血时间和再灌注时间、观察时间短有关。我们的研究还证实,脊髓缺血再灌注损伤延迟性瘫痪神经细胞所发生的神经元凋亡与机械性脊髓损伤所发生的细胞凋亡在空间和时间上有明显差异[8]：在空间上，凋亡细胞主要分布在脊髓灰质，特别是位于前角，以运动神经元多见，而机械性脊髓损伤所出现的凋亡细胞主要分布在脊髓白质，以胶质细胞为主；在时间上，凋亡细胞主要发生在缺血再灌注72h，而机械性脊髓损伤所出现的凋亡现象则发生在伤后24h。这些现象提示，这种细胞死亡是由于细胞生存环境的改变启动了细胞的自杀程序，导致了细胞死亡，即细胞凋亡。本实验通过HE染色及TUNEL法证实了脊髓缺血再灌注损伤所发生的延迟性瘫痪主要是神经细胞凋亡，细胞凋亡的存在对于脊髓损伤的发病机制研究具有重要的意义。脊髓损伤后细胞凋亡的客观存在更深刻更全面地揭示了脊髓缺血再灌注损伤的病理生理过程，即脊髓缺血再灌注损伤后主要是由于存在亚急性的细胞凋亡，使我们对脊髓缺血再灌注损伤的病理生理有一个新的认识。这也可以解释我们在临床上常常见到部分患者脊柱手术后数天内常出现脊髓损伤症状加重的现象。利用细胞凋亡，有效地调控细胞凋亡，是脊髓损伤的新思路、新途径，其中药物干预和基因治疗将是最有希望的治疗手段。
基金项目：陕西省卫生厅科研基金资助项目(No. 04012).
【】
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