褪黑素对花萼海绵诱癌素诱导的tau蛋白过度磷酸化的影响

【摘要】  目的 探讨褪黑素(Mel)对花萼海绵诱癌素(CA)在成神经瘤细胞诱导的tau蛋白过度磷酸化的影响及其机制。方法 采用鼠野生型成神经瘤细胞(N2awt)，给予CA处理，或同时给予50μmol/L Mel处理，用免疫荧光检测tau蛋白磷酸化水平，32P?特异底物标记技术检测GSK?3活性，免疫印迹技术检测P?Ser9?GSK?3β和GSK?3β的表达水平，P?Ser9?GSK?3β/GSK?3β的比率。结果 ①CA可在N2awt细胞使tau蛋白在Ser396/404位点和Ser198/202位点过度磷酸化，同时伴有GSK?3活性升高和P?Ser9?GSK?3β表达水平降低。②Mel对CA引起的tau蛋白过度磷酸化有保护作用；Mel同时对抗CA诱导的GSK?3活性升高和P?Ser9?GSK?3β表达水平降低。结论 Mel可减轻CA引起的tau蛋白过度磷酸化，其机制可能与调节细胞内P?Ser9?GSK?3β的表达水平和改变GSK?3活性有关。

【关键词】  花萼海绵诱癌素；tau；褪黑素；过度磷酸化；阿尔茨海默病

　　Effect of melatonin on calyculin A?induced tau hyperphosphorylation

　　ABSTRACT: Objective  To investigate the in vivo effect of melatonin (Mel) on calyculin A(CA)?induced tau hyperphosphorylation in neuroblastoma cells (N2awt). Methods  We treated N2awt cells with CA or CA and 50μmol/L Mel, detected the level of tau phosphorylation with immunofluorescence, and assayed the activities of GSK?3 and the ratio of GSK?3β phosphorylated at Ser9 site to total GSK?3β. Results  CA treatment led to tau hyperphosphorylation accompanied with the increased activity of GSK?3 and the decreased ratio of GSK?3β phosphorylated at Ser9 site to total GSK?3β. When the cells were incubated simultaneously with CA and 50μmol/L Mel, the CA?induced tau hyperphosphorylation, GSK?3 activation and the ratio of GSK?3β phosphorylated at Ser9 site to total GSK?3β decrease were attenuated. Conclusion  Melatonin protects neuroblastoma cells from CA?induced tau hyperphosphorylation. Its protection may be related to the regulation of GSK?3 activity and the ratio of GSK?3β phosphorylated at Ser9 site to total GSK?3β increase.

　　KEY WORDS: calyculin A; tau; melatonin; hyperphosphorylation; Alzheimer?s disease

　　阿尔茨海默病(Alzheimer?s disease, AD)的主要病理特征是在患者脑神经元中有大量的神经原纤维缠结 (neurofibrillary tangles, NFTs)。NFTs主要由异常过度磷酸化的tau蛋白构成，引起AD脑内tau蛋白过度磷酸化的机制尚不清楚。大量研究揭示受损的神经元内的蛋白磷酸酶活性降低是一种可能机制。目前认为脑中调节tau蛋白磷酸化的主要蛋白磷酸酶是丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶家族中的PP?2A，约占总tau蛋白磷酸酶活性的70%，而PP?1、PP?2B和PP?5各约占10%[1]。花萼海绵诱癌素(calyculin A, CA)是PP?2A和PP?1的特异性抑制剂。本研究组曾报道，在大鼠海马两侧注入CA后，大鼠出现了空间学习记忆障碍并且伴有CA1、CA2、CA3、CA4区tau蛋白的Ser396/Ser404位点的过度磷酸化[2]。作者曾报道，CA处理可使成神经瘤细胞(N2awt细胞)内的神经细丝发生过度磷酸化和PP?2A活性降低，而同时给予褪黑素(melatonin，Mel)处理，则可对抗CA引起的上述变化[3]。糖原合酶激酶?3(GSK?3)是可使tau的多个位点发生磷酸化的蛋白激酶[4]。根据报道GSK?3激活参与氧化应激诱导的tau蛋白磷酸化[5]，而另据报道，CA可引起氧化应激[6]，因此，我们推测CA处理诱导神经细丝磷酸化可能也与GSK?3激活有关，而抗氧化剂褪黑素也可能调节GSK?3活性。为此，我们分别用CA处理、Mel和CA同时处理N2awt细胞，用免疫荧光技术检测N2awt细胞内tau磷酸化水平及其分布，放射标记技术检测GSK?3活性，免疫印迹检测第9位丝氨酸磷酸化的GSK?3β(P?Ser9?GSK?3β)和GSK?3β的表达水平，量化分析P?Ser9?GSK?3β/GSK?3β的比率，进一步揭示了Mel对抗CA诱导的tau过度磷酸化的机制。

　　1  材料与方法

　　1.1  主要试剂  DMEM、Opti?MEM、胎牛血清(FBS)购自美国Gibco公司；丙烯酰胺(Arc)、N，N?亚甲叉?双丙烯酰胺(Bis)、四甲基乙二胺(TEMED)、十二烷基硫酸钠(SDS)、甘氨酸(Glycine)、小牛血清白蛋白(BSA)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、褪黑素(Mel)均为美国Sigma公司产品；过硫酸铵(AP)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白检测试剂盒购自美国Pierce公司；硝酸纤维素膜(NC膜)为 Hybond公司产品；单克隆抗体PHF?1(识别Ser396/404位点磷酸化的tau，1∶300)、Tau?1(识别非磷酸化的tau，1∶500)、多克隆抗体111e(识别总tau，1∶500)购自Sternberger公司；大鼠多克隆抗体GSK?3((1∶1000)、大鼠多克隆第9位丝氨酸磷酸化的GSK?3(抗体(1∶1000)购自Cell Signaling公司。所用抗体稀释液为50g/L脱脂奶粉，TBS/T配制；荧光素?异硫氰酸盐标记羊抗鼠、羊抗兔IgG抗体购自美国Sigma公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体和ECL显色系统购自美国Santa Cruz公司；CA购自美国Bio?chemical公司；γ?32P?ATP购自北京亚辉生物医药公司。

　　1.2  细胞培养  鼠野生型成神经瘤细胞贴壁生长细胞株(N2awt)由许华熙教授(The Burnham Institute, La Jolla, California, USA)提供，细胞用含50mL/L FBS的DMEM/Opti?MEM(1∶1)培养基，在5%(体积分数)CO2、37℃培养箱内进行培养，每2-3d更换培养液一次，细胞达70%-80%丰度时，传代或用于实验。给药处理前，细胞用无血清培养基培养12h诱导分化。细胞分为3组：正常对照组，加入含DMSO(<0.01%体积分数)的培养基；CA组，加入5nmol/L CA；Mel组，同时加入5nmol/L CA 50μmol/L Mel。

　　1.3  间接免疫荧光染色  细胞以5×105/孔的密度接种在24孔板中，孵育24-36h，待细胞生长达70%丰度时，去血清培养12h；按上述分组给药处理12h后，细胞用冷PBS洗2次，用40g/L多聚甲醛室温固定15min，PBS洗1次，0.3%(体积分数)Triton?X100破细胞膜5min，10g/L BSA孵育1h；细胞再分别与适当稀释的一抗(1∶300 PHF?1；1∶500 Tau?1；1∶1000 111e)在37℃孵育2h，PBS洗4次，再与二抗(荧光素异硫氰酸盐标记羊抗鼠IgG、羊抗兔IgG)37℃孵育1h，再用PBS洗4次，荧光显微镜(IX70, Olympus, Japan)摄像。

　　1.4  GSK?3活性测定  细胞接种于6孔板中，按上述分组，各组设5个平行孔，给药处理12h后，用温和裂解液[10mmol/L Tris?HCl, pH 7.4，150mmol/L NaCl，2mmol/L EGTA，2mmol/L DTT，0.1mmol/L Na3VO4，1% NP40，1mmol/L phenylmethylsulfonyl fluoride(PMSF)和2μg/μL aprotinin]在4℃匀浆裂解10min，18000g，4℃离心15min，取上清作为蛋白样品，采用BCA蛋白分析试剂盒进行蛋白浓度定量。蛋白样品的GSK?3活性以磷酸化的糖原合酶肽2为底物测定。方法如下：取7.5μg蛋白样品，加入总体积25μL、含有30mmol/L Tris?HCl pH 7.4、10mmol/L MgCl2、10mmol/L NaF、1mmol/L Na3VO4、2mmol/L EGTA、10mmol/L β?ME、200μmol/L γ?32P?ATP(每皮摩尔ATP的cpm值为1500)和20μmol/L phospho?GS底物的磷酸缓冲液中，振荡混匀，30℃孵育30min，加入25μL 300mmol/L H3PO4终止反应。各反应体系分别取25μL反应液滴在磷酸纤维膜上，以75mmol/L H3PO4洗涤液漂洗膜3次后，膜置于60℃干燥过夜；将膜放入液闪瓶内，加入二甲苯闪烁液，用液体闪烁仪在30℃读数(此读数即是底物结合的放射活性)。GSK?3的活性单位以nmol/min·g protein表示。GSK?3的相对活性以正常对照组为1，处理组与对照组的百分比值表示。

　　1.5  蛋白质印迹(Western blot)分析  按上述分组加药处理细胞12h后，弃培养基，预冷的PBS洗2次，加入细胞裂解液90μL(50mmol/L Tris?HCl，pH 8.0，150mmol/L NaCl, 10g/L Triton X?100，1g/L SDS，0.2g/L NaN3，100mg/L PMSF，1mg/L aprotinin，PMSF和aprotinin临用前加入)，在冰上静置10min，用细胞刮刮起细胞并转移到Eppendorf微量离心管中，加入4×加样缓冲液30μL，煮沸10min，超声破碎(3×5s)，12000g离心10min，取上清作为蛋白样品，采用BCA蛋白分析试剂盒进行蛋白浓度定量。取各蛋白样品20μg加入各个泳道，用1×加样缓冲液补充使各泳道加样量相等。蛋白质经100g/L SDS?PAGE凝胶电泳分离后，考马斯亮蓝R?250染色30min，再脱色1h，扫描分析各蛋白样品条带的吸光无差异，则各泳道加入的样品蛋白总量相等。再以同样加样方法将样品加入各泳道，蛋白质经100g/L SDS?PAGE凝胶电泳分离后转移至NC膜上；NC膜用50mL/L脱脂牛奶室温封闭1h，分别加入单克隆抗体GSK?3β和P?Ser9?GSK?3β，4℃孵育过夜，然后用含1g/L Tween?20的TBS(TTBS)漂洗(3×5min)；再加入适当稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗，37℃孵育1h，TTBS漂洗(3×5min)；加入ECL显色液，显色1min，终止显色并将胶片置于NC膜上，在暗室里曝光1min，扫描胶片获得的免疫印迹结果在Kodak Digital Science ID图象分析系统中进行平均吸光度分析，反映各组P?Ser?GSK?3β和GSK?3β的表达水平，并计算P?Ser?GSK?3β/GSK?3β的比率。

　　1.6  统计学处理  实验数据以±s表示，应用SPSS 10.0统计分析软件，采用配对t检验分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2  结果

　　2.1  Mel对CA诱导的tau蛋白过度磷酸化的影响  用识别Ser396、404位点磷酸化的tau的抗体PHF?1和识别Ser198/202位点非磷酸化的tau的抗体Tau?1以及识别总tau的抗体111e进行免疫荧光染色。免疫荧光图像显示(图1)：CA组与正常对照组和Mel组相比，细胞变圆、突起缩短，细胞膜上出现小泡；识别总tau的111e在3组间的免疫荧光强度相比无显著差异，但CA组荧光主要分布于胞体，而正常对照组和Mel组荧光分布于胞体和突起。PHF?1在正常对照组和Mel组的荧光极弱，在CA组显著强于二者。Tau?1抗体的荧光在正常对照组和Mel组较强，在CA组显著弱于二者。结果表明：CA引起tau在Ser396、404位点和Ser198/202位点发生过度磷酸化，Mel可对抗CA引起的上述位点的过度磷酸化。

　　2.2  Mel对CA诱导的GSK?3活性增强的影响  GSK?3可使tau的Ser396、404位点发生磷酸化。用放射标记技术检测GSK?3的活性，CA组的GSK?3相对活性为对照组的(204±5.7)%，Mel组的GSK?3相对活性为对照组的(46.5±1.8)%，与CA组相比显著降低，且低于正常对照组(图2)。结果表明CA处理后激活GSK?3，Mel能对抗CA引起的GSK?3激活。

　　图1  Mel对CA诱导的培养N2awt细胞的tau过度磷酸化的影响（略）

　　Fig.1 Effect of melatonin on calyculin A?induced tau hyper?phosphorylation in cultured N2awt cells (×20)

　　A, B, C: immunofluorescence of N2awt with 111e; D, E, F: immunofluorescence of N2awt with PHF?1; G, H, I: immunofluorescence of N2awt with Tau?1;  A, D, G: un?treated group; B, E, H: CA?treated group; C, F, I: 50μmol/L Mel and CA treated group (Scale bar=20μm)

　　图2  Mel对CA诱导的GSK?3活性增强的影响（略）

　　Fig.2 Effect of Mel on calyculin A?induced GSK?3 activity increase

　　**P<0.01 vs. untreated group; ##P<0.01 vs. CA?treated group; △△P<0.01 vs. untreated group. 1: un?treated group; 2: CA?treated group; 3: 50μmol/L Mel and CA treated group

　　2.3  Mel对CA诱导的P?Ser9?GSK?3β降低的抑制作用  磷酸化GSK?3α的第21位丝氨酸和GSK?3β的第9位丝氨酸可以抑制GSK?3的活性。我们用分别识别GSK?3β和P?Ser9?GSK?3β的抗体，通过Western?blot检测GSK?3β和P?Ser9?GSK?3β的表达水平，并对P?Ser9?GSK?3β/GSK?3β的比率进行量化分析。免疫印迹结果显示：CA组和对照组相比，GSK?3β显色无变化，但P?Ser9?GSK?3β的显色却显著减弱(图3A)；Mel组与CA组相比GSK?3β显色无变化，但P?Ser9?GSK?3β的显色却显著增强(图3A)。量化分析结果表明：CA处理引起P?Ser9?GSK?3β/GSK?3β的比率降低，Mel可对抗之(图3B)。

　　图3  Mel对CA诱导的P?Ser9?GSK?3β降低的抑制作用（略）

　　Fig.3 Depressed effect of Mel on calyculin A?induced decreased expression of P?Ser9?GSK?3β

　　Western blots (A) and quantitative analysis (B) of ratio of Ser?9?phosphorylated GSK?3β to total level of GSK?3β in N2awt cells.

　　**P<0.01 vs. untreated group; ##P<0.01 vs. CA?treated group. △P<0.05 vs. untreated group. 1: un?treated group; 2: CA?treated group; 3: 50μmol/L Mel and CA treated groups

　　3  讨论
   
　　AD患者脑神经元中广泛存在的NFTs主要由过度磷酸化的tau构成。目前关于引起tau过度磷酸化的机制尚不清楚，但大量实验表明可能与蛋白激酶与蛋白磷酸酶的比例失衡有关。我们曾报道蛋白磷酸酶PP?2A和PP?1的特异性抑制剂CA可导致N2awt细胞AD样神经细丝磷酸化，Mel对其有保护作用[3]。在本实验中，通过免疫荧光技术发现CA处理可导致N2awt细胞tau在Ser396/404位点和Ser192/198位点发生过度磷酸化, 同时引起GSK?3活性显著升高，P?Ser9?GSK?3β降低。本实验结果提示：蛋白磷酸酶抑制剂处理模拟AD样tau蛋白磷酸化不仅与抑制蛋白磷酸酶活性有关，也与蛋白激酶的活性改变有关。根据Gomez?Ramos 等的报道，脂质过氧化产物丙烯醛可激活GSK?3引起tau过度磷酸化[7]，我们以前也报道CA引起tau过度磷酸化同时伴有氧化应激及脂质过氧化[8]。我们推测：CA可能通过引起氧化应激和脂质过氧化使P?Ser9?GSK?3β降低和GSK?3活性升高。具体机制尚需进一步实验研究证实。
   
　　Mel最初用于AD患者改善睡眠，却发现其也可改善患者的行为障碍和认知障碍。研究表明Mel具有抗氧化和对抗Aβ毒性的作用。本实验发现Mel可对抗CA引起的tau过度磷酸化；同时，Mel对抗CA诱导的P?Ser9?GSK?3β降低和GSK?3活性增加。根据作者以前报道Mel可对抗CA诱导的氧化应激和脂质过氧化[8]，及本组其他成员报道Mel可对抗wortmanin诱导的氧化应激、GSK?3过度激活和tau过度磷酸化[5]，我们推测：Mel除了通过抗氧化作用外，也可能直接激活其他蛋白激酶使GSK?3β的丝氨酸9位磷酸化增加，从而间接调节GSK?3的活性。
   
　　总之，本研究首次揭示了Mel对CA处理神经瘤细胞引起的tau蛋白过度磷酸化有保护作用，其机制可能与其调节GSK?3活性及P?Ser9?GSK?3β/GSK?3β的比率有关。

基金项目：国家基金资助项目(No. 30170221,No. 30100057)

【】
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