熊果酸通过影响Bax 和Bcl

         作者：　张贵平，黎银燕，吕嘉春，区彗坚

【关键词】  细胞凋亡

    Ursolic acid induces apoptosis through effects on Bax and Bcl2 expression in human MCF7 cells

　　【Abstract】 AIM:  To study the effects of ursolic acid (UA) on human MCF7 cell apoptosis and the mechanism probably involved. METHODS:  MCF7 cells were treated with different concentrations of UA (0, 10, 30, 50 μmol/L ) for 24 h, apoptotic cells with condensed or fragmented nuclei were visualized by Ho33258 staining in a fluorescence microscope. After MCF7cells treated with UA (0,  20, 50 μmol/L ) for 24 h, subG1 peak and cell cycle were detected  with PI staining by FCM. After MCF7cells treated with and 50 μmol/L of  UA  for 24 h, the protein expression of cytochrome c, Bcl2 and Bax were detected by immunofluorescence cell staining (SABCCy3) and the grey levels of immunofluorescence on cytochrome c and Bcl2 and Bax were analyzed with the use of QWin. RESULTS:  Twentyfour hours  after UA treatment, apoptotic cells increased dosedependently and the morphological changes of MCF7 cells displayed many hallmark features of apoptosis, including chromatin aggregation and fragmented nuclei. SubG1 rates in 0, 20 and 50 μmol/L of UA detected by FCM were 0.05, 0.22 and 0.43 respectively. Compared with 5 mL/L  DMSO, 50  μmol/L of UA significantly increased the grey levels of Bax (59.3±7.8, 213.6±7.4, P<0.01), cytochrome c (88.2±6.9, 188.1±15.4, P<0.01) and the grey ratio of Bax/Bcl2 (1.0±0.1, 2.4±0.4, P<0.01) and increased noticeably the grey level of Bcl2 (58.1±6.1, 92.1±12.4,  P<0.01). Cytochrome c induced by 50 μmol/L of UA released into cytoplasm. CONCLUSION: Apoptosis induced with UA in MCF7 cells is related to increasing the ratio of Bax/bcl2 and releasing cytochrome cdependent apoptotic pathway. Our study indicates that UA may be a potential Chinese medicinal component for breast neoplasm.

　　【Keywords】  ursolic acid; MCF7 cells;  apoptosis; genes, Bax; genes, Bcl2; cytochrome c

　　【摘要】  目的： 探讨中药成分熊果酸（ursolic acid, UA）诱导MCF7人乳腺癌细胞的凋亡作用，并通过分析UA作用后的MCF7细胞Bax, Bcl2, cytochrome c蛋白表达的变化，探讨其诱导MCF7细胞凋亡的分子机制. 方法： 采用细胞培养技术，用0, 10, 30和50 μmol/L的UA处理MCF7细胞24 h，用Ho染细胞，在荧光显微镜下观察凋亡细胞的形态变化. 用0, 20和50 μmol/L的UA处理MCF7细胞24 h，用PI染细胞，在流式细胞仪上测定细胞周期的变化. 用0和50 μmol/L的UA处理MCF7细胞24 h，采用荧光免疫细胞化学SABCCy3法检测Bax, Bcl2, cytochrome c蛋白表达，在荧光显微镜下拍照，用QWin图像分析软件测定Bax, Bcl2, cytochrome c荧光灰度值. 结果： 用0, 10, 30和50 μmol/L 的UA处理MCF7细胞24 h，随着UA浓度增加，在荧光显微镜下出现凋亡细胞增多，细胞呈现典型的凋亡形态学特征，核质浓集和凋亡小体. 用0, 20和50 μmol/L 的UA处理MCF7细胞24 h，流式细胞仪检测亚G1峰比例分别为0.05, 0.22, 0.43与对照组5 mL/L DMSO比较，50 μmol/L 的UA 使MCF7细胞中的Bax灰度（59.3±7.8, 213.6±7.4, P<0.01）和cytochrome c灰度（88.2±6.9， 188.1±15.4， P<0.01）增加， Bax/ Bcl2灰度比值升高（1.0±0.1， 2.4±0.4， P<0.01），Bcl2灰度(58.1±6.1, 92.1±12.4, P<0.01)稍有增加. UA促进线粒体放释cytochrome c进入胞质. 结论： UA诱导MCF7细胞凋亡，其机制涉及到Bax/ Bcl2比值升高引起线粒体释放cytochrome c所依赖的凋亡调节信号通路. 表明乳腺癌，UA可能是有效的中药成分.

　　【关键词】 熊果酸；MCF7细胞；细胞凋亡；基因,Bax； 基因,Bcl2；细胞色素C类

　　0　引言

　　熊果酸（ursolic acid, UA），属三萜类化合物，资源丰富. 许多研究表明，UA具有诱导多种肿瘤细胞凋亡的作用［1-3］. 但UA对MCF7细胞的凋亡作用机制不明，我们以MCF7细胞为材料，应用荧光免疫细胞方法和图像分析技术，探讨UA诱导MCF7细胞凋亡机制.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　人乳腺癌细胞株MCF7引自广州医学院分子生物学中心；熊果酸（ursolic acid, UA,  MW456）购自药品生物制品鉴定所，为药检标准品，用DMSO配制成10 mmol/L；碘化丙锭（propidium iodine, PI）、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide, DMSO）、Hoechst33258（Ho）、RNA酶（RNase A），胰酶（1∶250）均为Sigma公司产品；羟乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES）为Amresco产品；RPMI 1640培养基溶液(吉诺生物医药技术有限公司)，含2 g/L NaHCO3, 3.5 g/L HEPES；小牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所)；SABCCy3试剂盒（武汉博士德）；小鼠抗人cytochrome c (A8)、Bax(B9)、Bcl2(c2)单克隆抗体（Santa Cruz）.  仪器：多功能倒置荧光显微镜（Nikon TE300）；图像采集系统（Leica DC200）、图像处理和分析系统（Leica, QWin）；流式细胞仪（美国BD公司, FACSVantage）；CO2培养箱（NAPCO）.

　　1.2方法

　　1.2.1细胞培养MCF7细胞采用含100 mL/L小牛血清的RPMI1640培养基，含105 u/L链霉素和青霉素，置于37℃含50 mL/L CO2的细胞培养箱中培养. 1.25 g/L胰蛋白酶和0.2 g/L EDTA消化，传代.

　　1.2.2凋亡细胞形态观察法MCF7细胞传代至24孔板中,每孔2×104个细胞，24 h后更换新鲜培养基，加UA 0, 10, 30和50 μmol/L，继续培养24 h，加入Ho 10 mg/L,继续培养20 min，PBS洗. 紫外光激发，在多功能倒置显微镜下观察并拍照.

　　1.2.3Bax,  Bcl2, cytochrome c蛋白表达的检测将MCF7细胞传代至48孔板中,每孔1.6×104个细胞，24 h后更换新鲜培养基，加UA 50 μmol/L，继续培养24 h，PBS洗后，加37  g/L多聚甲醛室温固定0.5 h，PBS洗. 用0.5 mL/L H2O2甲醇，30 mL/L Triton 各处理0.5 h，PBS浸洗，以后步骤按SABCCy3试剂盒说明进行. 依次滴加山羊血清、一抗（Bax, Bcl2, cytochrome c鼠抗人）、二抗、Cy3，各步骤间均用PBS洗3次，37℃温箱中反应20~30 min，加Cy3后在暗处放置30 min，PBS洗，加封片剂（PBS:甘油=1∶1）. 在荧光显微镜下，绿色光激发，观察并拍照. 用QWin测量细胞荧光灰度. 每组6孔，每孔采5张视野图，每张图上细胞灰度值，5张视野图的平均值为每一孔的平均值.

　　1.2.4检测细胞周期和亚G1峰实验参照［4］进行，加UA 20, 50 μmol/L，培养24 h后，收集细胞. 均用-20℃  700 mL/L乙醇固定，PI染色液(含PI 10 mg/L， RNase A 100 mg/L)染色，流式细胞仪上检测，分析104个细胞. 并根据DNA含量直方图中出现的“亚G1峰”凋亡细胞百分数，及不同期细胞百分数.
  
　　统计学处理： 数据以x±s表示，用SPSS11.0统计软件进行分析，组间比较用成组t检验和t′检验，P<0.05为差异有统计学意义.

　　2结果

　　2.1UA诱导细胞凋亡的形态变化在光镜下，对照组细胞界限清晰，胞质丰富，胞核圆形或椭圆形，饱满， 染色质均匀分布. UA终浓度10 μmol/L时，MCF7细胞形态未出现明显的变化；而UA终浓度30和50 μmol/L时，MCF7细胞变化明显，细胞核变圆，缩小，染色质呈斑块状，荧光强度高（Fig 1）.

　　2.2UA对MCF7细胞Bax和Bcl2蛋白表达的影响Bax和Bcl2蛋白定位于细胞质. 在对照组，Bax和Bcl2蛋白的红色荧光非常弱，表示Bax和Bcl2蛋白表达量低. 而在UA 组，Bax蛋白呈强红色荧光，表示Bax蛋白表达量增多. UA组灰度比对照组增加了2.6倍（Fig 2，Tab 1）；Bcl2蛋白红色荧光稍有增加，表示Bcl2蛋白表达量微有增多，UA组灰度比对照组增加了0.59倍（Fig 3， Tab 1）；UA组Bax/Bcl2灰度比值增加，比对照组增加了1.4倍.
2.3UA对MCF7细胞cytochrome c蛋白表达的影响cytochrome c定位于细胞质. 在对照组， cytochrome c红色荧光弱，主要在贴近胞膜的位置，表示cytochrome c蛋白表达量低. 而在UA 组，靠近胞膜的位置及胞质中cytochrome c呈强红色荧光，表示不仅cytochrome c蛋白表达量增加，灰度比对照组增加了1.1倍，而且是弥散到了胞质中（Fig  4， Tab 1）. 表1UA对MCF7细胞 cytochrome c, Bax和Bcl2蛋白表达的影响 （略）

　　2.4UA对细胞凋亡及周期的影响不同浓度的UA与MCF7细胞孵育24 h后，出现相当比例的DNA含量小于二倍体的亚G1凋亡峰，在同一时间，不同UA浓度作用下，凋亡率增高，细胞不同周期的比例也发生变化（Tab 2）.表2UA对MCF7细胞周期分布的影响（略）

　　3讨论
 
　　哺乳动物细胞凋亡有两条信号传导途径，一条是细胞死亡受体介导的外源性信号传导途径，另一条是线粒体介导的内源性信号传导途径，来自这两条途径的凋亡信号都要激活下游的Caspase3，再激活Caspase级联反应导致细胞凋亡［5］.   Bcl2为抑制凋亡成员，Bax为促进凋亡成员. 当Bax 蛋白表达增多形成同源二聚体，则促进细胞凋亡；当Bcl2蛋白表达增加，与Bax形成异源二聚体则抑制细胞凋亡. Bax/Bcl2比值升高，在线粒体膜上形成同源二聚体，使膜通透性改变，导致线粒体中cytochrome c的释放，与其他因子结合后激活Caspase3，诱导Caspase级联反应［6］. 我们研究表明，在用药前，Bax, Bcl2, cytochrome c蛋白表达处于低水平状态，cytochrome c紧贴在胞膜的位置，Bax/Bcl2的比值为1∶1，MCF7细胞无凋亡发生；用UA处理MCF7细胞后，Bax蛋白表达显著增加，而Bcl2蛋白表达稍有增加，此时Bax/Bcl2两者比例达到了2.4∶1，胞内cytochrome c蛋白表达显著增加，且弥散在整个胞质中，表示有游离线粒体的cytochrome c，结果MCF7细胞凋亡发生，我们没有观察到Bcl2下调现象. 在文献［3］，UA通过内源性线粒体途径激活caspase3诱导M4Beu黑色素瘤细胞凋亡时，出现Bax上调，Bcl2下调现象，可能是UA诱导不同类型癌细胞凋亡的作用方式有所差异.

　　FCM周期分析，在药物终浓度50 μmol/L时，亚G1峰为0.43，说明有0.43比例的细胞有DNA降解，可见UA 诱导细胞凋亡，与Bax/Bcl2比值升高，引起cytochrome c表达增加和线粒体释放cytochrome c激发下游的凋亡因子有关. 据以上推论，UA诱导MCF7细胞凋亡与升高Bax/Bcl2比值，释放cytochrome c凋亡调节信号通路有关.

　　【文献】

　　［1］ Andersson D, Liu JJ, Nilsson A, et al. Ursolic acid inhibits proliferation and stimulates apoptosis in HT29 cells following activation of alkaline sphingomyelinase  ［J］. Anticancer Res, 2003;23(4):3317-3322.

　　［2］ Hsu YL, Kuo PL, Lin CC. Proliferative inhibition, cellcycle dysregulation, and induction of apoptosis by ursolic acid in human nonsmall cell lung cancer A549 cell  ［J］. Life Sci, 2004; 75(19): 2303-2316.

　　［3］ Harmand PO, Duval R, Delage C, et al. Ursolic acid induces apoptosis through mitochondrial intrinsic pathway and caspase3 activation in M4Beu melanoma cells  ［J］. Int J Cancer, 2005;114(1):1-11.

　　［4］ Hollosy F, Idei M, Csorba G, et al. Activity of caspase3 protease during the process of ursolic acid and its derivativeinduced apoptosis ［J］. Anticancer Res, 2001;21(5):3485-3491.

　　［5］ Gupta S. Molecular signaling in death receptor and mitochondrial pathways of apoptosis ［J］. Int J Oncol, 2003;22(1):15-20.

　　［6］ Cory S, Adams JM. The Bcl2 family: Regulators of the cellular lifeordeath switch  ［J］. Nat Rev Cancer, 2002;2(9):647-656.