TAG1抗原HLA
【关键词】 ,,睾丸肿瘤
Prediction of HLAA2 restricted cytotoxic T lymphocyte epitopes of TAG1 and expression and purification of fusion proteins of these epitopes and Hsp70
【Abstract】 AIM: To predict HLAA2 restricted cytotoxic T lymphocyte (CTL) epitopes of the novel cancer/testis antigen TAG1 and to express and purify the fusion proteins of these epitopes and Hsp70 in prokaryotic system. METHODS: Longdistance prediction system SYFPEITHI and polynomial method were used to predict the HLAA2 restricted CTL epitopes of TAG1. The epitopes were then cloned into the expression vector after synthesizing and annealing the nucleotide sequences of these epitopes. After induced with IPTG, the expressed fusion proteins were purified with GSTrap FF column. RESULTS: Three HLAA2 restricted CTL epitopes of TAG1 were selected. The fusion genes PGEXbwHsp70 were constructed and the fusion proteins were acquired successfully. CONCLUSION: The fusion proteins of Hsp70 and three HLAA2 restricted CTL epitopes are expressed and purified successfully, which will be helpful in studying their immune functions and develop new peptide vaccines of malignant melanoma.
【Keywords】 testicular neoplasms; antigens, neoplasms; Heat Shock proteins 70; TAG1; Epitopes; polynomial method
【摘要】 目的： 对在恶性黑素瘤（MM）组织中表达率极高并具有强免疫原性的新型睾丸肿瘤（C/T）抗原TAG1表位的HLAA2限制性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）表位进行预测，并表达、纯化所预测表位与热休克蛋白70（Hsp70）融合蛋白，为特异性主动免疫MM打下物质基础. 方法： 利用SYFPEITHI 法和多项式方案结合预测TAG1的HLAA2限制性CTL表位，并将预测所得表位基因片断双串连后进行生物合成，克隆入带有GST标签并含Hsp70基因的原核表达载体，在IPTG诱导表达后，用GST蛋白纯化系统纯化. 结果： 预测并得到了三个TAG1的HLAA2限制性表位，成功地构建了表位与Hsp70的原核表达质粒（PGEXbwHSP70）；表达和纯化得到了三个表位与Hsp70的可溶性融合蛋白. 结论： 成功获得三个预测表位与Hsp70的融合蛋白，为进一步研究其免疫功能、研制TAG1对MM的特异性治疗肽疫苗奠定了基础.
【关键词】 睾丸肿瘤；抗原，肿瘤；TAG1；热休克蛋白70；表位；多项式方案
0引言
恶性黑素瘤（MM）发病率正呈逐年上升趋势，已有许多MM相关抗原及其限制性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）相关表位被发现，但部分肿瘤抗原及其表位表达量较低、免疫原性较差，不能刺激足够强的抗肿瘤特异性免疫效应. 新型C/T抗原TAG1是新近发现的抗原，在MM组织中表达率极高，并具有较强的免疫原性，是较为理想的MM治疗候选抗原，但是其表位研究目前刚刚起步［1］. 热休克蛋白70（Hsp70）作为分子伴侣，可增强与其结合蛋白的抗原性，产生特异性的杀伤效应，因而Hsp70肿瘤肽复合物是有效的抗肿瘤疫苗［2］. 因人群的HLAA2型占53%，本研究利用CTL表位预测结合重建技术，对新C/T抗原HLAA2限制性CTL表位进行预测，将其基因与Hsp70融合、表达、纯化，为MM肽疫苗的研制奠定基础.
1材料和方法
1.1材料
原核表达载体pGEX4T1与GST亲和层析柱为Clontech公司产品；BamHⅠ, Hind Ⅲ和EcoRⅠ等内切酶均为TaKaRa公司产品；T4 DNA连接酶为promega产品；大肠杆菌DH5α由第四军医大学西京皮肤科实验室保存；pGEX4T1Hsp70E7 由西京医院皮肤科党育平博士构建.
1.2方法
1.2.1TAG1表位的远程预测利用Intenet 进入SYFPEITHI 主页(www.uni2tuebingen.de/uni/kxi), 对TAG1抗原HLA2A2限制性CTL 表位进行远程预测［3］，再将所选表位进行限制性抗原肽多项式方案分析，即将以上表位所有氨基酸残基对应的Ri［4］值相加,选择分值大于选定阈值的抗原肽为候选表位. 本研究所选择阈值为-24.
1.2.2候选表位基因片段序列的生物合成核酸序列合成由上海生物工程公司完成，序列上下游分别加入BamHⅠ, Hind Ⅲ酶切位点残基（下划线部分），并将所预测表位九肽所对应核酸序列串连为双表位后进行合成，其单链序列如下： bw1为GATCCCTGCTCTTGAGGCTGGAGTGCAATGTTCTGCTCTTGAG
GCTGGAGTGCAATGTTA，bw2为GATCCACGCTGTCACGTCTCAGCAATAGACTGACGCTGTCACGTCTCA
GCAATAGACTGA，bw3为GATCCTTTTTGTTACTTCTGAATTCTACTACATTTTTGTTACTTCTGAATTCTACT
ACAA，同时将以上序列的反向互补链进行生物合成，以使二者退火后形成具有粘性末端的双链DNA片断，以备连接使用.
1.2.3单链表位序列的退火将预测各表位两条反向互补序列稀释至100 pmol/L，各取2 μL加入到46 μL退火缓冲液中，放入盛有95℃水的烧杯中，让其冷却，以备连接使用.
1.2.4融合基因原核表达载体的构建将pGEX4T1Hsp70E7经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后，产物经10 g/L琼脂糖电泳后，回收4900 bp质粒片段；取退火产物(带相应酶切位点粘性末端)1 μL、回收质粒片断5 μL, T4连接酶1 μL、连接缓冲液1 μL、去离子水2 μL，于16℃连接过夜，常规转化DH5α，接种氨苄青霉素（Amp）阳性的LB平板后筛选阳性克隆，酶切鉴定，送测序证实.
1.2.5融和基因在大肠杆菌中的表达将pGEXbwHsp70质粒转化大肠杆菌DH5α后，接种于6 mL含100 mg/L Amp阳性的LB培养液，37℃震荡培养过夜，取过夜菌1∶100接种500 mL Amp阳性的LB培养液，37℃剧烈震荡（180 r/min）培养至A600 nm≈0.8，加入IPTG至终浓度为0.3 mmol/L，28℃诱导表达4 h. 取1 mL菌液留样，离心，去上清，加入100 μL TE和100 μL 2×蛋白电泳Buffer，煮沸10 min，行10%的SDSPAGE电泳鉴定.
1.2.6表达蛋白的纯化将以上500 mL培养液离心，沉淀重悬于25 mL冰冷的STE液，加入100 g/L溶菌酶25 μL，冰浴15 min，超声裂解细菌至菌液澄清后，4℃ 12 000 g离心15 min，取上述裂解细菌上清，用0.45 μm滤器过滤上清. 采用10 mL PBS平衡1 mL GST rap柱，0.5 mL/min. 将细菌裂解上清以0.5 mL/min速度上样；采用10 mL PBS清洗GST rap柱，0.5 mL/min；用洗脱缓冲液洗脱结合蛋白，分段收集，共收集6 mL. SDSPAGE鉴定目的蛋白，-70℃保存.
2结果
2.1SYFPEITHI远程预测和多项式分析筛选出三个表位（Tab 1）. 表1TAG1的 HLAA2限制性表位预测结果（略）
2.2融合基因原核表达质粒的构建通过双表位肽段所对应核酸序列的退火，并与BamHⅠ和HindⅢ双酶切后的pGEX4T1Hsp70E7连接，构建的融合质粒pGExbwHsp70用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切后可见2020 bp左右条带，与Hsp70加表位序列大小一致（Fig 1），经测序Hsp70和表位基因片段均正确，说明表位和Hsp70融合载体构建成功.
2.3融合蛋白的诱导表达和纯化经IPTG诱导后，表达Mr约98×103的蛋白（包括GST部分）；表位与Hsp70融合蛋白大多以包含体形式存在. 但实验中，调整诱导表达时间至4 h，温度28℃和IPTG终浓度为0.3 mmol/L，可显著提高可溶性蛋白的表达水平. 经分离纯化后得到了Mr约98×103可溶性蛋白（Fig 2）.
3讨论
MM因其恶性程度高、易转移的特点，目前临床的尚无良法. TAG1作为一种新型的C/T抗原，具有强免疫原性，因此，TAG1可能是非常理想的MM疫苗候选抗原［1］. 有效的表位预测和鉴定方法可大大提高寻找CTL表位的效率，利用Intenet网上提供的数据库(www.unituebingen.de/uni/kxi和www.wehih.wehi.edu.au/mhcpep ) 对蛋白表位进行预测，然后利用多项式方案进行筛选，已被广泛应用. Dong等［5］采用以上两种方法对肿瘤抗原MAGEn进行HLAA2限制性表位预测，得到了多个表位. 我国汉族人群具有HLAA2分布较高的优势［6］，研究TAG1的HLAA2限制性CTL表位,对于我国MM的免疫治疗、研制有效多肽疫苗具有重要意义. 我们的研究正是采用了SYFPEITHI主页预测与多项式分析相结合的方法，对TAG1进行表位预测，得到了TAG1的三个HLAA2限制性表位. 同时为了更好的发挥CTL表位的免疫效应，我们还将所得九肽进行双表位串连，使表位数量表达增加一倍，进一步提高了其免疫功能.
Hsp70作为一种分子伴侣，能够发挥免疫佐剂的作用，增强肿瘤抗原的作用［7］. Castelli等［8］将gp100, TRP2, MART1等肿瘤抗原与Hsp70融合后，发现可以增强这些蛋白的免疫原性和HLA－Ⅰ限制性CTL反应；Jing等［9］也发现MAGE1与Hsp70的融合蛋白可产生更强的MAGE1特异性的肿瘤杀伤效应. 我们的研究将TAG1所预测的3个HLAA2表位与Hsp70进行融合表达，就是利用Hsp70的分子伴侣效应，以增强表位免疫原性和CTL反应，为治疗MM提供更强有力的免疫辅物.
我们采用肿瘤抗原CTL表位预测结合多项式分析法,对TAG1 这一新型C/T抗原的HLAA2限制性CTL 表位进行了预测、筛选，获得候选表位三个, 我们同时融合了分子伴侣Hsp70，采用GST纯化层析柱纯化得到了该融合蛋白，为MM疫苗研制奠定了基础.
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