人NDRG1的GST融合表达、纯化及相互作用蛋白检测
【关键词】 谷胱甘肽琼脂糖
GST fusion expression and purification of human NDRG1
【Abstract】 AIM: To better understand the function of NDRG1 and look for the interact protein through pulldown technic. METHODS: We digested the NDRG1 cDNA from the constructed vector NDRG1pPROEXHTb and transfered it into another vector pGEX4T1. After gene was sequenced, the recombinant vector NDRG1pGEX4T1 was transformed into E. coil DH5α and the strains highly expressing soluble GSTNDRG1 in LB medium containing ampicillin were obtained. The fusion protein was then purified by Glutathione Sepharose 4B and was incubated with HHCC. The interact protein with NDRG1 was observed by SDSPAGE. RESULTS: There was a new strip at Mr 4.0×104 when the purified protein and HHCC were incubated. CONCLUSION: The interact protein with NDRG1 is found in HHCC.
【Keywords】 NDRG1; GST; gene expression; glutathione sepharose 4B
【摘要】 目的： 为了更好的了解NDRG1的功能，通过pulldown技术寻找与NDRG1相互作用的蛋白. 方法： 从已构建好的NDRG1pPROEXHTb重组载体中酶切下NDRG1 cDNA，插入融合表达载体pGEX4T1，序列测定后，转化DH5α感受态细胞，在含氨苄青霉素的LB中高效表达. 表达的GSTNDRG1经过谷胱甘肽琼脂糖4B亲和层析纯化，并与高表达细胞系HHCC孵育，通过SDSPAGE检测和NDRG1相互作用的蛋白. 结果： 纯化蛋白和HHCC孵育后，在Mr 4.0×104处出现新增条带，应是与NDRG1相互作用的未知蛋白. 结论： 在肿瘤细胞HHCC中存在与NDRG1相互作用的蛋白.
【关键词】 NDRG1；GST；基因表达；谷胱甘肽琼脂糖4B
0引言
Ndrg家族（Nmyc downstreamregulated gene family） 是近几年发现的一系列和信号转导相关的分子. 它包括NDRG1NDRG4，其中NDRG4又分三个亚型： NDRG4B, NDRG4B(var)和NDRG4H. 而NDRG1是Kokame等1996年在研究高同型半胱氨酸血症引起动脉粥样硬化的机制时，在培养的人脐静脉内皮细胞中发现的一种由同型半胱氨酸诱导产生的产物，经证实为一个含有394个氨基酸，大小为Mr 47 000的蛋白，当时被命名为还原剂衣酶孝反应蛋白(RTP)，随后又有不同实验室也相继克隆到编码RTP的基因，并且赋予了它多个名字［1］. NDRG1在结肠癌细胞系中高表达，因而被视为是与细胞分化程度呈正相关的抑癌基因. 但新近报道，NDRG1不仅与肿瘤细胞的分化有关，也与动脉粥样硬化、血栓形成、组织缺氧有关，同时还参与应激反应，可被多种诱导剂诱导等［2］，所以检测NDRG1相互作用的蛋白会为其功能研究提供明确线索.
1材料和方法
1.1材料
质粒提取和胶回收试剂盒购自北京天为时代公司；低分子量蛋白(marker)购自上海生化试剂公司；BamHⅠ, EcoRⅠ, IPTG购自大连宝生生物公司；protease inhibitor cocktail购自Roche公司；质粒pGEX4T1, DH5α细胞株由第四军医大学生物化学与分子生物学教研室提供,NGDRG1pPROEXHTb由第四军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室张景赠送；还原谷胱甘肽购自华美生物公司；谷胱甘肽琼脂糖珠购自CLONTECH公司；Western发光底物为pierce产品；其余试剂均为国产分析纯.
1.2方法
1.2.1表达载体的构建用BamHⅠ/EcoRⅠ将NDRG1从NGDRG1pPROEXHTb中切下，插入pGEX4T1表达载体，构建出重组表达载体（NDRG1pGEX4T1）.
1.2.2融合蛋白的表达将重组质粒转化E.coil DH5α感受态细胞，挑阳性克隆，在含氨苄青霉素的LB培养基中培养过夜，取5 mL菌液转接于500 mL含氨苄青霉素的LB中，37℃，3 h，待A600 nm值约达0.5左右时加入IPTG至终浓度为0.2 mmol/L，温度调至27℃，诱导表达3 h，然后於8000 g离心15 min，收取菌体，加入20 mL缓冲液（137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 10 mmol/L Na2HPO4, 2 mmol/L KH2PO4, 1 mmol/L PMSF, pH 7.4），吹悬并于-70℃冻存. 反复冻融3次菌体，然后超声裂菌（输出频率60 Hz，每次8 s, 10 min，冰上），离心（12 kg/min, 4℃, 10 min）, 分别取适量上清液和沉淀进行SDSPAGE电泳［3］，检验NDRG1pGEX4T1可溶性.
1.2.3融合蛋白的纯化取上清20 mL，加入1 mL谷胱甘肽琼脂糖珠(50%)，4℃，孵育30 mins,离心，沉淀用1 mL含1 mmol/L PMSF的1×PBS混悬，存于4℃，取适量进行SDSPAGE分析，并以NDRG1单抗为一抗，兔抗鼠为二抗进行Western验证.
1.2.4准备肿瘤细胞提取物复苏人肝癌细胞HHCC，传代于75 cm2培养瓶，待细胞长满后，收集菌体，并加入1 mL细胞裂解液（50 mmol/L TrisHCl, pH 7.4, 0.05 mmol/L EDTA, 10 mmol/L CHAPS and protease inhibitor cocktail）重悬，超声裂菌（输出频率60 Hz，每次8 s，5次，冰上），离心（12 000 g, 4℃, 60 min），收集上清，存于-70℃. 取5 μL上清以NDRG1单抗为一抗，兔抗鼠为二抗进行Western验证.
1.2.5GST pulldown［4］将收集的肿瘤细胞上清和纯化的NDRG1pGEX4T1融合蛋白（固定于谷胱甘肽琼脂糖珠）4℃孵育2, 4, 6, 8和10 h；对照为细胞裂解液与NDRG1pGEX4T1 4℃孵育2 h. 离心，沉淀加入洗脱液（20 mmol/L GSH, 150 mmol/L NaCl, 50 mmol/L Tris.Cl），4℃, 2 h, 2000 r/min, 10 min，收上清并加入TCA至20%，冰上放置2 h，离心（12 000 g, 4℃, 15 min）, 弃上清，用丙酮洗3遍，风干. 加尿素溶解后，SDSPAGE分析.
2结果
2.1表达载体的构建用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切NGDRG1pPROEXHTb释放1203 bp的Ndrg1片段，插入pGEX4T1表达载体，构建出重组表达载体NDRG1pGEX4T1（Fig 1）.
2.2NDRG1pGEX4T1融合蛋白的表达和纯化将重组表达载体NDRG1pGEX4T1转化大肠杆菌DH5α，27℃，经0.2 mmol/L IPTG诱导，在Mr 6.6×104左右出现新的蛋白条带. 除去GST标签(Mr 2.6×104), 得到的相对Mr与NDRG1理论相对Mr基本相等，表明NDRG1可以在含氨苄的LB中表达. 将诱导表达的细菌沉淀重悬于缓冲液，并用冻融和超声裂解，取适量上清液、沉淀，进行SDSPAGE分析，在Mr 6.6×104处均有明显条带（Fig 2）.
表达的融合蛋白经谷胱甘肽琼脂糖珠孵育纯化，并进行Western验证. 结果显示，超声裂解的上清经Glutathione Sepharose 4B亲和层析以后，在Mr 6.6×104左右出现两条带(Fig 3A). 用NDRG1单抗为一抗，鼠抗兔为二抗，进行Western验证，显示在同样Mr处出现两条带（Fig 3B）.
2.3HHCC提取物的Western验证以NDRG1单抗为一抗，鼠抗兔为二抗，Western验证HHCC上清提取物，显示在Mr 6.6×104处出现明显条带（Fig 4）.
2.4GST pulldown细胞裂解液上清与融合蛋白孵育不同时间后，用还原谷胱甘肽洗脱并SDSPAGE分析（Fig 5），显示1, 2 h的孵育时间最好. 2，在Mr 4.3×104处有新增条带，应该是与NDRG1相互作用的蛋白.
3讨论
NDRG家族是近几年发现的一组新基因. 根据Zhou等的报道，NDRG1和NDRG3, NDRG4虽然在组织分布上有明显差异，但是在氨基酸组成上却有57%～65%的同源性. 作为最早发现的NDRG1，早期的研究显示其与细胞的增殖能力呈负相关，在肿瘤细胞中过度表达会降低细胞的增殖速度，促进细胞的分化，并减弱癌细胞的转移能力，所以可能是潜在的抑癌基因；同时，最新的结果又表明NDRG1在脑瘤、乳腺癌和肾癌等多种癌组织中高表达［5］，可被视为一种新的癌症检测标记.
我们的实验将人Ndrg1片段 插入pGEX4T1表达载体，转入DH5α进行原核表达，发现在上清和沉淀中均含有融合蛋白GSTNDRG1，说明其部分可溶. 纯化后在Mr 6.6×104处出现两条带，经Western验证，证明其均是融合蛋白GSTNDRG1，究其原因，可能是因为用原核载体表达真核蛋白，其表达环境差异太大造成. 同时在所选细胞系中，经Western验证NDRG1在HHCC中高表达，说明可在此细胞系中寻找NDRG1的相互作用蛋白.最后，融合蛋白GSTNDRG1与HHCC裂解上清孵育后，我们不仅看到2 h为最佳的结合时间，而且也惊喜发现在Mr 4.3×104处出现新的条带，说明在HHCC中存在和NDRG1相互作用的蛋白. 这为我们在后续实验中用质谱测定新条带的序列、找出与其同源的蛋白，并通过这些蛋白的性质进一步推测NDRG1的性质提供了帮助.
【】
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