SMART 技术构建肾乳头状腺癌及癌旁组织的cDNA文库

          作者：成瑜 李旭 陈葳 杨玉琮

【关键词】  肾肿瘤

　　Construction of cDNA libraries of renal papillary adenocarcinoma tissue and its side tissue with SMART technology

　　【Abstract】 AIM:  To construct the cDNA libraries of renal papillary adenocarcinoma tissue and its side tissue by SMART technology.  METHODS:  Switch mechanism at 5′end of mRNA template technology, SMART technology, was used to construct the libraries. The purified Poly(A)+RNA was used as template, Powerscript reverse transcriptase was used to transcribe and 5′oligo as a short extended template was added to the 5′ end of mRNA to enrich the fulllength cDNAs. After amplification, the ds cDNA was digested by sfiI, sizefractionated by columns (CHROMA SPIN400) and then recombined to the λTripIEx2 vector. After package, the libraries were tittered, the rate of recombination ( blue/white) was determined and then the cDNA libraries were amplified. RESULTS:  The titer of the cDNA libraries of renal papillary adenocarcinoma tissue and its side tissue were 1.4×106 pfu・mL-1 and  2.6×106 pfu・mL-1, respectively. After amplification, the rates increased to 6×1011 pfu・mL-1 and 9×1011 pfu・mL-1, respectively. CONCLUSION:  Our successfully constructed cDNA libraries are fulllength libraries with high efficiency and can be screened by probes and antibodies to find the associated genes of the renal papillary adenocarcinoma.

　　【Keywords】 kidney neoplasms;  cDNA library; SMART

　　【摘要】 目的： 运用SMART 技术构建肾乳头状腺癌及癌旁组织的cDNA文库. 方法： 运用mRNA 5′末端的模板转换方法，即SMART技术，以纯化的Poly(A)+RNA为模板，用Powerscript逆转录酶进行转录，并在mRNA 的5′末端添加一段5′ oligo作为延伸后的模板，从而富集全长 cDNA.  cDNA扩增后， 经sfiI酶切、CHROMA SPIN400洗脱，与λTripIEx2载体连接并用载体蛋白包装后，测定滴度和重组率，并扩增，建成cDNA文库. 结果： 构建的肾乳头状腺癌及癌旁组织cDNA文库滴度分别为1.4×106 pfu・mL-1和2.6×106 pfu・mL-1，重组率均>98%，扩增后滴度分别达6×1011 pfu・mL-1和9×1011 pfu・mL-1. 结论： 我们构建的人肾乳头状腺癌及癌旁组织cDNA文库为高效、全长cDNA文库，可以用做探针、抗体等免疫学筛选, 进一步探寻与肾乳头状腺癌相关的基因.

　　【关键词】 肾肿瘤；cDNA文库;SMART技术

　　0引言

　　肾癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，生物学行为极为多变，其发病机制及发生的分子生物学基础至今不明. 鉴于此，我们利用SMART(switch mechanism at 5′end of mRNA template)技术分别构建了肾乳头状腺癌及其癌旁组织的cDNA文库，为肾乳头状腺癌相关基因的研究工作奠定了基础.

　　1材料和方法

　　1.1材料人肾乳头状腺癌和癌旁正常组织(距癌组织1.5 cm以上)由西安大学第一泌尿外科提供. TRIzol试剂购自Gibco公司; SMARTTM cDNA library construction kit购自Clontech公司; OligotexTMdT30 mRNA purification kit购自Takara株式会社; 载体包装蛋白为Epicentre产品; IPTG, XGal购于Promega公司，其余均为国产分析纯.

　　1.2方法

　　1.2.1总RNA提取及mRNA纯化人肾乳头状腺癌和癌旁组织各0.5 g入预冷的匀浆器中，随即加入TRIzol 5 mL，于冰浴中研磨成匀浆，氯仿异丙醇抽提，750 mL・L-1乙醇洗涤干燥后溶于200 μL无RNase水中［1］. mRNA提取按照OligotexTMdT30 mRNA purification kit操作说明书进行.

　　1.2.2cDNA文库的构建取1.0~1.5 μg Poly(A)+RNA，以5′oligo(5′AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGGCCGGG3′)及3′oligo(dT)［5′ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATGd(T)30 N’N3’, N=A,G,C,or T；N’=A,G,or C］为引物合成cDNA第一链，用5′ 引物(5′AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT3′)及3′oligo(dT)引物［5′ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATGd（T）30 N’N 3’  N=A,G,C,or T；N’=A,G,or C］通过引物延伸法扩增合成双链cDNA. PCR扩增条件为72℃ 10 min, 95℃ 20 s, 随后进行循环: 95℃ 5 s，68℃ 8 min，其中肾乳头状腺癌进行4个循环，癌旁组织进行5个循环（PE 扩增仪2400型）. PCR反应结束后，反应液经蛋白酶K处理以去除其中的酶类，合成的双链cDNA用sfiI酶切及CHROMA SPIN400柱层析洗脱，收集0.5～5.0 kb之间的组分，在T4 DNA连接酶作用下，将ds cDNA与λTripIEx2 载体（经sfiI酶处理过）的去磷酸化臂连接，16℃水浴过夜. 随后置冰浴中2 h，65℃水浴灭活连接酶，于30℃进行包装.

　　1.2.3文库滴定、重组率测定和扩增cDNA文库滴度测定按Sambrook等［2］推荐的方法进行，重组率测定采用蓝白斑筛选方法，即向含有噬菌体和E. coli. XL1Blue混合液的上层琼脂中分别加入IPTG和XGal，于90 mm平板上铺板，置37℃孵育过夜，分别蓝色噬菌斑和无色噬菌斑数，并计算其百分比. 文库的扩增按Sambrook等［3］推荐的方法操作.

　　2结果

　　2.1总RNA的提取和mRNA的纯化用紫外分光光度仪检测提取的总RNA的吸光度(A)，分别为：肾乳头状腺癌A260 nm/A280 nm=1.89, 癌旁组织A260 nm/A280 nm=1.92，经10 g・L-1琼脂糖凝胶电泳检测见mRNA为主要集中于0.5~5.0 kb之间 的一片状条带.2.2cDNA文库的构建及cDNA文库的滴度、重组率和扩增纯化的poly(A)+RNA 经逆转录及引物延伸PCR扩增后，产生ds cDNA，经11 g・L-1琼脂糖/溴化乙锭凝胶电泳后在0.4~5.0 kb之间形成一片状条带（Fig 1）. ds cDNA经sfiI酶切及柱层析洗脱后，收集的各组分于11 g・L-1琼脂糖/溴化乙锭凝胶电泳（Fig 2），收集0.5~5.0 kb组分与载体λTripIEx2的去磷酸化臂连接，建成文库.

　　图1－图2　(略)

　　构建的cDNA文库经测定，肾乳头状腺癌组织滴度为1.4×106 pfu・mL-1，肾癌旁正常组织滴度为2.6×106 pfu・mL-1， 用XGal和IPTG顶层琼脂LB平板检测cDNA文库蓝白斑比例，重组率>98%, 文库经扩增后, 肾乳头状腺癌组织滴度为6×1011 pfu・mL-1，癌旁正常组织滴度为9×1011 pfu・mL-1.3讨论

　　肿瘤的发生与一系列肿瘤相关基因的表达和结构的异常密切相关，而肿瘤抗原就是这些异常基因表达的产物. 认识和鉴定肿瘤抗原并把它们作为肿瘤疫苗的靶向是肿瘤免疫研究的重点课题. 目前，寻找这些肿瘤抗原的主要途径仍是构建该组织的cDNA文库，通过核酸或抗体筛选出目的基因，以为临床的诊断、以及预后提供依据.

　　自1976年Efstratiadis等［４］及Rougean等［５］分别报道成功地进行了cDNA的分子克隆，至今ｃDNA文库已有２０余年，于国内外均已建立了多种组织及细胞株的ｃDNA文库［６，７］，但尚未有肾乳头状腺癌的cDNA文库构建报道. cDNA文库的构建过程可大致分为总RNA提取、ｍＲＮＡ纯化、cDNA合成、cDNA克隆入载体和包装等几个步骤，其中cDNA的合成是其中最复杂也是文库建立成败的关键因素［８］. 我们所构建的cDNA文库采用SMART 技术，运用了powerscript逆转录酶，它缺乏Rnase H活性，可以合成更长的cDNA片段. 另外， 实验中采用的5′ oligo片段在mRNA的5′末端充当了一个短的延伸后的模板，5′oligo可以与真核生物mRNA 5′末端的7甲基鸟苷帽结构特异性地结合，且5′ oligo在3′末端有一个oligo(G)序列，当逆转录到达mRNA 5′末端时，此逆转录酶的终端转移酶活性即在cDNA的5′末端增加了几个另外的核苷（主要是脱氧胞嘧啶）. 5′oligo作为一个延伸后的模板，逆转录酶将其进行模板转换，并继续复制到寡核苷酸的末端，使生成的ss cDNA含有mRNA完整的5′末端，此序列也互补于5′oligo, 在后来的PCR扩增中充当了一个通用的导引起始位点(锚定序列)，只有那些在5′末端含有锚定序列的ss cDNA才可充当被指数扩增的模板，而不完全的cDNAs以及从poly(A)-RNA转录的cDNA则不会被扩增. 这样即可去除基因组DNA和poly(A)-RNA的干扰. 这种选择性的扩增帮助我们构建成一个具有高库容量的全长的cDNA文库. 在合成的cDNA 5′和3′末端分别含有非均一的sfiI限制性酶切位点, 其分别由5′oligo片段和3′oligo(dT) 引物所携带.  由于sfiI对某些碱基可以非特异性识别, 所以cDNA的5′和3′末端被sfiI识别的碱基序列并不完全相同, cDNA和λTripIEx2载体经sfiI酶消化后，可以直接进行克隆连接，并且消除了接头的自连接，提高了文库的重组效率. 而且sfiI的酶切位点在哺乳动物中几乎不存在，因此，所有的cDNAs经过sfiI酶消化后仍可保持其完整性，免除了甲基化步骤.

　　人类基因组计划的顺利实施和基因组测序的快速进展，使得基因的结构及功能的研究已成为近几年的热点. 本研究运用SMART技术构建了高效的人肾乳头状腺癌组织及其癌旁组织的cDNA文库，可以对其进行随机挑选克隆测序分析，以获得新的未知基因，或进行文库的免疫学筛选，以寻找肾乳头状腺癌的特异性和非特异性相关基因，从根本上阐明肾乳头状腺癌发生的分子生物学基础，为肾乳头状腺癌的特异性诊断及基因治疗奠定理论基础.

　　【】

　　［1］ Zhong D, Jiang B, Pan DB. RNA preparation ［A］. In: Jiang B, Zhang YL, Zhou DY. Routine experiment methods of molecular biology［M］.  Beijing: Renmin Junyi Chubanshe (People’s Military Medical Press), 2000: 56-62.

　　［2］ Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Culture of λ phage and extraction of DNA［A］. In: Zhang DZ, Wang AL, Jin DY (translation). Molecular cloning, A laboratory manual ［M］. 2nd ed in Chinese . Beijing: Kexue Chubanshe (Science Press), 1992:127- 138.

　　［3］ Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Amplification of cDNA library［A］. In: Li C,Li YH, Jin DY(translation). Molecular cloning, A laboratory manual ［M］. 2nd ed. Beijing: Kexue Chubanshe (Science Press), 1992:448- 449.

　　［4］ Efstratiadis A, Kafatos FC, Maxam Am, Maniatis T. Enzymatic in vitro synthesis of globin genes［J］. Cell, 1976;7:279-288.

　　［5］ Rougeon F, Mach B. Stepwise biosynthesis in vitro of globin genes from mRNA by DNA      polymerase of avian myeloblastosis virus［J］. Proc Natl Acad Sci USA,1976;73:3418-3422.

　　［6］ Swaroop A, Xu J. cDNA libraries from human tissues and cell lines［J］. Cytogenet Cell Genet, 1993;64:292-294.

　　［7］ Huang WJ, Xiao HS, Zhang P, Zhang X, Cheng BF, Yao LB, Ju G. The construction of cDNA library of rat cerebral cortex［J］. Disi Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ）, 2000;21(1):127-128.

　　［8］ Huang BC, Chen ZN, Huang WJ, Jiang SZ. The conditions of cDNA synthesis on constructing cDNA library［J］. Disi Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2001;22（3）:278-279.