凋亡相关蛋白Apr

【关键词】  Apr

　　Cloning, sequencing and preliminary expression of apoptosis related protein 2

　　【Abstract】 AIM: To clone and express the apoptosis related protein 2 (Apr2) from the model of the apoptosis cells of HL60. METHODS: The model of apoptosis cells of HL60 was established, total RNA was isolated from the cells and mRNA was reversely transcribed into cDNA. PCR was used to amplify the apr2 coding region and the PCR product was cloned into PGEMT Easy vector and sequenced. It was then subcloned into expression vector PGEX4T2 and induced with IPTG. RESULTS:  Apr2 gene was cloned into PGEMT Easy vector and the sequence was confirmed. SDSPAGE showed that the fusion protein was expressed as inclusion bodies in E. coli. Band density scanning of stained gel was performed to estimate the percentage of the recombinant protein in the total bacteria protein, which was up to 40%. CONCLUSION:  Apr2 gene has been successfully cloned and preliminary expression product of fusion protein has been obtained, which lay the basis for further purification and studies of Apr2's structure and function.

　　【Keywords】 Apr2 gene; apoptosis; cloning ; fusion protein; inclusion bodies

　　【摘要】 目的： 从HL60细胞凋亡模型中克隆凋亡相关蛋白Apr2编码区基因,并对其进行表达,为进一步研究Apr2的结构功能及多克隆抗体的制备奠定基础.方法： 建立HL60细胞凋亡模型,提取HL60凋亡细胞总RNA,以RTPCR方法获取Apr2 cDNA编码区全序列,将其与PGEMT Easy载体连接,转化E.coli DH5α,构建重组克隆载体PGEMTEasy/apr2,测序正确后,将目的片段亚克隆入PGEX4T2原核表达载体,并转化大肠杆菌, IPTG诱导重组蛋白质表达,分析蛋白质在细菌中的表达分布,进行凝胶自动扫描分析. 结果：序列分析表明,与GenBank中已登录的Apr2 cDNA编码区序列比较,完全一致.表达的融合蛋白占菌体总蛋白质的40%以上,主要以包涵体的形式存在. 结论：成功的获得了细胞凋亡模型HL60中Apr2 cDNA编码区的克隆及其融合蛋白表达产物.

　　【关键词】 Apr2基因;凋亡;克隆;融合蛋白;包涵体

　　0引言

　　凋亡是一个受遗传调控的自身编码死亡方式，涉及许多基因的共同作用［1］，这些基因中仍有相当一部分未知. 朱峰等［2］人通过建立HL60细胞凋亡模型，运用改良消减杂交法（improved subtractive hybirdization, ISH）克隆出了10个凋亡相关新基因，并在GenBank中登录，其中凋亡相关蛋白Apr2的生化性质、结构、功能以及与凋亡的确切关系还不清楚，国内外尚无研究报道. 我们利用HL60细胞凋亡模型，对Apr2基因编码区进行克隆、表达及序列分析，为进一步研究Apr2的结构功能及制备多克隆抗体奠定基础.

　　1材料和方法

　　1.1材料HL60细胞系、大肠杆菌DH5α由本实验室保存; PGEMT Easy  及Wizard Plus MiniPreps DNA Purification system购自Promega公司；PGEX4T2购自Pharmacia公司; TRIzol总RNA提取试剂盒购自Gibco brl Life Technology公司; TaKaRa RNA LA PCR Kit(AMV)逆转录PCR试剂盒、限制性内切酶XhoⅠ，BamHI，T4 DNA连接酶购自TaKaRa Biotech公司；RPMI 1640购自华美生物制品有限公司; 新生小牛血清购自杭州四季青生物工程材料研究所； GeneRulerTM 100 bp DNA Ladder及GeneRulerTM 100 bp DNA Ladder plus购自Fermentas公司.

　　1.2方法

　　1.2.1引物设计与合成以GenBank中人HL60 cDNA编码区序列（ACCESSION：AF143236）为模板，设计引物，序列如下：5′ GGATCCATGGTTTCCTTGTGGGTG；3′ CTCGAGTTAATCCCAAACGGTGGCTG；并在上游引物中加入BamHI酶切位点，在下游引物中加入XhoⅠ酶切位点(下划线部分为酶切位点). 引物由上海生工生物工程有限公司合成.

　　1.2.2HL60细胞凋亡模型的建立［2,3］将处于对数生长期的HL60细胞稀释至5×106个・mL-1，加入1 mmol・L-1 ATRA（全反式维甲酸）2 μL，使培养液中ATRA终浓度为1 μmol・L-1，培养12 h后收集细胞.

　　1.2.3RTPCR取约5×106个HL60凋亡细胞，按TRIzol总RNA提取试剂盒说明书提取总RNA,取5 μL用紫外分光光度仪测定样品浓度. 提取的RNA逆转录合成cDNA，取上述引物，进行PCR扩增. 反应参数为：95℃预变性5 min， 95℃ 50 s；55℃ 30 s；72℃ 30 s；共30个循环，72 ℃延伸5 min；4℃保存. 取PCR反应产物5 μL，10 g・L-1琼脂糖凝胶电泳鉴定.

　　1.2.4Apr2克隆载体的构建参照文献［4，5］，PCR产物经电泳鉴定后，试剂盒回收目的片段，并与PGEMTEasy连接，转化E.coli DH5α,利用氨苄青霉素抗性筛选重组克隆. 提取阳性克隆的质粒DNA，进行BamHI和XhoⅠ双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定. 初步鉴定正确的重组克隆对其进行序列分析.

　　1.2.5Apr2重组表达载体的构建将用BamHI，XhoⅠ双酶切纯化后的目的cDNA apr2亚克隆到经同样双酶切后的载体PGEX4T2中，质粒与插入DNA的克分子数比为1∶3，得到的重组表达质粒PGEX4T2/ apr2. 经BamHI和XhoⅠ双酶切后，琼脂糖凝胶电泳鉴定.

　　1.2.6Apr2编码区cDNA在E.coli的表达［6］将表达载体PGEX4T2/apr2转化感受态E.coli，在含氨苄青霉素的LB固体培养基平板上过夜，次日挑选一个单菌落接种LB液体培养基中过夜，取100 μL摇起的菌液加至5 mL新鲜LB培养基中37℃，2.5 h后，取1 mL菌液做诱导前对照，余加入5 μL 0.42 mol・L-1的异丙基硫代βD半乳糖苷（IPTG）诱导3 h后,进行150 g・L-1 SDSPAGE,分析目的蛋白质的表达情况.
　　
　　1.2.7样品的大量制备及初步纯化吸取菌液按1∶100接种新鲜LB液体培养基中扩大培养，方法同上. 诱导后菌液离心，保留沉淀，加Tris・HCl悬起沉淀，超声波处理，离心，分离上清. 沉淀加入3 mL 8 mol・L-1的尿素，悬起沉淀，超声波处理. 取诱导后的上清、沉淀进行150 g・L-1 SDSPAGE电泳,分析蛋白质的分布情况及凝胶自动扫描分析定量. 将诱导后沉淀上样进行电泳回收，切取回收目的条带1/3置于自制的电洗脱装置中，1~2 h后吸取洗脱后液体，150 g・L-1 SDSPAGE电泳.

　　2结果

　　2.1获得Apr2 cDNA编码区序列提取的总RNA经RTPCR后,扩增产物进行10 g・L-1琼脂糖凝胶电泳鉴定，可见一条约339 bp的DNA条带，与预期相符(Fig 1).

　　图1目的基因的PCR扩增产物　(略)

　　2.2Apr2 cDNA编码区的克隆及表达载体的酶切鉴定RTPCR产物分别与PGEMT Easy和PGEX4T2载体连接得到的阳性克隆，经BamHI和XhoⅠ双酶切后电泳鉴定显示，与PCR产物及目的基因片断长度相符，因此，初步确定得到了预期的cDNA重组克隆和表达载体. 分别命名为PGEMTEasy/apr2和PGEX4T2/apr2 (Fig 2).

　　2.3测序结果经测序分析表明获取的Apr2 cDNA编码区序列与GenBank中已登录序列一致.

　　2.4Apr2编码区cDNA在E.coli中的诱导表达重组PGEX4T2/apr2转化E.coli，经IPTG诱导表达后，在Mr约38×103处出现一新生蛋白条带，与预期结果一致(Fig 3). 经凝胶自动扫描分析，表达的融合蛋白占菌体总蛋白的40%.

　　2.5表达产物的分布经大剂量诱导表达，表达产物主要在细菌裂解后的沉淀中，而上清几乎没有靶蛋白的存在. 将靶蛋白质回收，经电洗脱装置初步纯化后，可见到单一目的条带(Fig 4).