香烟烟雾提取物对气道上皮细胞增殖和FIP200表达的影响

【关键词】  气道上皮细胞

    Effect of cigarette smoke extract on proliferation and cycle of human airway epithelial cell and its FIP200 expression

　　【Abstract】 AIM: To study the effect of cigarette smoke extract （CSE ） on the proliferation and cycle of human airway epithelial cell and its mechanism. METHODS:  After airway epithelial cells were treated with CSE, the proliferation was measured with MTT and the distribution of different cell cycles was detected with flow cytometry. FAKfamily interacting protein of Mr 200 000 (FIP200) mRNA expression level, FAKfamily interacting protein of Mr 200 000（FIP200）expression level and the association of FIP200 with focal adhesion kinase（FAK）were analyzed respectively by reverse transcriptionpolymerase chain reaction（RTPCR）, Western blot and immunoprecipitation. RESULTS:  CSE inhibited the proliferation of human airway epithelial cells and arrested the epithelial cells in G1 phase of cell cycle. The number of epithelial cells in S and G2 phase dramatically decreased （P<0.01）. CSE increased the expression level of FIP200 mRNA and FIP200 and the association of FIP200 with FAK（P<0.01）. The effects of CSE on airway epithelial cells were all in a doseandtime dependent manner. The expression of FIP200 mRNA and FIP200 and the association of FIP200 with FAK were positively correlated to the increased number of epithelial cells in G1 phase（P<0.01） and negatively correlated to the proliferation and the number of epithelial cells in S and G2 phase（P<0.01）. CONCLUSION:  CSE can inhibit the proliferation of human epithelial cells and the increased expression of FIP200 may be one of the factors responsible for it.

　　【Keywords】 CSE;  airway epithelial cell;  cell proliferation;  FIP200

　　【摘要】 目的： 研究香烟烟雾提取物（CSE）对气道上皮细胞增殖和细胞周期的影响及其作用机制. 方法： 利用MTT法研究CSE对气道上皮细胞增殖的影响，采用流式细胞术分析气道上皮细胞细胞周期的影响，以RTPCR和Western blot检测气道上皮细胞FIP200 mRNA和蛋白表达，以免疫共沉淀检测FIP200与局灶粘着斑激酶（FAK）连接状况.  结果： CSE干预的气道上皮细胞MTT吸光度比对照组明显降低，G1期细胞增多，S和G2期细胞明显减少（P<0.01），FIP200 mRNA, FIP200的表达水平以及FIP200与FAK的连接均显著增高（P<0.01），且随CSE干预时间和CSE浓度而增大；气道上皮细胞FIP200表达水平和FIP200与FAK连接的增高均与G1期细胞增多呈正相关（P<0.01），与S和G2期细胞减少呈负相关（P<0.01）. 结论： CSE显著抑制气道上皮细胞的增殖，FIP200的高表达可能是其作用机制之一.

　　【关键词】 香烟烟雾提取物； 气道上皮细胞； 细胞增殖；FIP200

　　0引言

　　气道上皮是呼吸器官对抗有害刺激的第一道防线，上皮受损后的及时修复是维持气道稳态的重要环节. 支气管上皮细胞损伤脱落是哮喘和慢性阻塞性肺病（COPD）等呼吸道疾病的起始环节和病理基础，而气道疾病的缓解有赖于上皮完整性的修复与维持. 其修复包括细胞向损伤部位迁移，细胞增殖和细胞细胞、细胞细胞外基质黏附等中心环节［1，2］. 吸烟是呼吸道疾病的重要原因之一，它可能通过多种机制引起呼吸道疾病的发生. 已有很多实验证实由吸烟引起的炎症对气道疾病的重要性，但吸烟是否通过影响气道上皮细胞增殖从而影响其损伤修复尚未有报道，我们将以此为目的进行实验研究.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　按Akamura等［3］方法，将2支去过滤嘴香烟（红双喜牌，武汉卷烟厂生产）于一个注射器驱动装置连接抽吸而燃着，10 min燃完，吸入的烟雾经另一个出口通入50 mL无血清培养液中制成悬液. 悬液用1 mol/L NaOH调至pH 7.4，经0.22 μm微孔滤膜过滤备用. 制备的香烟烟雾提取物(cigarette smoke extract, CSE)在30 min之内用于实验. 人支气管上皮细胞系MBE由医学院肿瘤研究所程书钧院士惠赠, 用DMEM:F12无血清培养基培养，加入人重组表皮生长因子5 μg/L,胰岛素5 g/L,转铁蛋白10 g/L,氢化可的松0.2 mol/L,三碘甲状腺素0.65 g/L,肾上腺素0.5 g/L,牛垂体粗提物35 g/L,乙醇胺0.5 mol/L（均购自Gibco公司）,庆大霉素100 g/L,青霉素100 g/L,链霉素100 g/L，最后用NaHCO3滴定到pH 7.0. 细胞接种于覆盖有40 mg/L FN的培养板，37℃含50 mL/L CO2温箱培养，待细胞80%融合成片时，换用含CSE的培养液继续培养.

　　1.2方法

　　96孔培养板接种细胞，培养干预后，每孔先后加5 g/L MTT液20 μL和DMSO 150 μL，用酶联免疫检测仪于波长490 nm处测定各孔吸光度；其中每个浓度或时间点重复3次实验，每次重复6个复孔. 制备单细胞悬液，预冷的无水乙醇固定，PBS漂洗，用4℃碘化丙啶染色30 min，取1×106个细胞在流式细胞仪上进行细胞周期分析. 采用异硫氰酸胍酚氯仿一步法从细胞中提取总RNA为模板，按MBI公司RTPCR试剂盒说明书合成cDNA为模板，加入Taq酶和dNTP等进行PCR.  FIP200引物由上海博亚公司合成：上游引物：5′TCAGGTGGGAGATTTG3′，下游引物：5′TCCATGATACGGCTTT3′，扩增片断大小269 bp；βactin上游引物：5′GTGGGGCGCCCCAGGCACCA3′，下游引物：5′CTCCTTAATGTCACGCACGTATTC3′，扩增片断大小540 bp. 另用预冷的RIPA细胞裂解缓冲液0.25 mL裂解细胞，用改良的Lowry法进行蛋白定量. 取蛋白10 μg，进行SDSPAGE转膜，用1∶1000的抗FIP200多抗（Santa Cruz）进行杂交，二抗为1∶2000的辣根过氧化物标记的山羊兔抗IgG（中山公司），最后用增强的化学发光试剂显色（Santa Cruz）. 另取100 μg总蛋白，加入FIP200多抗（Santa Cruz），反应后加入50 μL A蛋白Sepharose珠进行沉淀，后行SDSPAGE转膜，用1∶1000的抗FAK多抗杂交，二抗为1∶2000的辣根过氧化物标记的山羊兔抗IgG（中山公司），最后用增强的化学发光试剂显色.
统计学方法： 实验数据以x±s表示，MTT吸光度值多组间均数比较用双因素方差分析，其余多组间均数比较用单因素方差分析，当方差不齐时采用反正弦平方根变换为齐性后采用单因素方差分析，线性相关关系用直线相关分析，P<0.05认为差异有统计学意义. 数据分析采用SAS软件.

　　2结果

　　2.1CSE对气道上皮细胞增殖的影响气道上皮细胞经50，100和200 mL/L CSE干预6，12，24和36 h A值均降低（P<0.01）；呈时间和浓度依赖性（P<0.01, Fig 1）.

　　流式细胞分析（Tab 1, 2）中G2期数据方差不齐，均先采用反正弦平方根变换为方差齐性后再做单因素方差分析，发现100 mL/L CSE干预6，12，24和36 h G1期细胞数比对照组增高（P<0.01），S期及G2期细胞数量明显减少(P<0.01)，而且这些变化均随CSE浓度的增加而有增大的趋势（Tab 2）.表1100 mL/L CSE不同干预时间细胞周期各期细胞所占的百分比（略）表2不同浓度CSE干预24 h气道上皮细胞细胞周期各期所占的百分比（略）

　　2.2FIP200 mRNA表达100 mL/L CSE干预不同时间FIP200 mRNA表达水平均有显著增高（P<0.05），12 h时其增高达高峰，其后表达水平略下降，但与12 h组相比无差异（Tab 3，Fig 2）. 不同浓度CSE干预24 h FIP200 mRNA表达水平均明显增高（P<0.01），而且其表达水平随CSE干预浓度的增高而有升高的趋势（Tab 4，Fig 3）.表3100 mL/L CSE不同干预时间细胞FIP200表达水平和FIP200与FAK结合状态的影响（略）表4不同浓度CSE干预24 h对气道上皮细胞FIP200蛋白表达和FIP200与FKA结合状态的影响（略）

　　2.3FIP200蛋白表达及与FAK的连接100 mL/L CSE不同干预时间FIP200表达水平均有显著增高（P<0.05），24 h时其增高达高峰，其后略有下降，FIP200与FAK连接的变化趋势同FIP200蛋白表达变化趋势（Tab 3，Fig 4）. 不同浓度CSE干预24 h FIP200蛋白表达明显增高（P<0.05），而且FIP200表达水平随CSE干预浓度的增高有升高. CSE干预组FIP200与FAK的结合也有显著增高（Tab 4，Fig 5, P<0.05）.

　　100 mL/L CSE干预气道上皮细胞不同时间FIP200 mRNA表达、FIP200蛋白表达及FIP200和FAK的连接均与MTT中A值、G2期和S期细胞数减少呈负相关，G1期细胞数增加呈正相关（P<0.01）；不同浓度CSE干预后气道上皮细胞24 h增殖和细胞周期与FIP200表达水平的相关性趋势与以上相似.

　　3讨论

　　气道上皮细胞在哮喘和COPD等呼吸道疾病的发生中起着十分重要的作用，维持气道上皮细胞结构完整和功能稳态是防止呼吸道疾病发生的重要环节，而此依赖于气道上皮细胞的损伤后修复的能力，即迁移和增殖分化等能力. 吸烟是引起呼吸道疾病的重要原因之一，我们用CSE干预气道上皮细胞，MTT实验发现CSE明显抑制气道上皮细胞的增殖；流式细胞分析也发现CSE干预后G0G1期细胞数量明显增加，S期、G2M期细胞数量减少，并且以上这些变化呈现显著的时间和浓度依赖性，说明CSE引起气道上皮细胞DNA复制和有丝分裂障碍，增殖周期阻断在G0G1期. 以上结果均提示：CSE能显著抑制气道上皮细胞的增殖. 因此吸烟能通过抑制气道上皮细胞的增殖而抑制损伤后修复，从而促进呼吸道疾病的发生发展.

　　影响细胞增殖的因素很多，其中FAK是很多细胞系迁移增殖信号传导通路中的重要激酶之一，它的活化和酪氨酸磷酸化有赖于整合素和细胞外基质的结合［4］. FAK的活化和高表达能够促进细胞增殖［5,6］，但FAK的调节机制仍不十分清楚. 最近发现的细胞质蛋白FIP200，它和FAK一样广泛表达于许多组织细胞，并且通过直接结合于FAK的激酶区而抑制FAK的活性和分子功能；转染FIP200或其片断使细胞高表达FIP200能够抑制FAK活性，而破坏FIP200和FAK的连接则促进FAK激酶活化及由此引起的一切分子功能如细胞增殖迁移等［7］；我们发现气道上皮细胞FAK表达无明显变化，但FIP200与FAK的结合随FIP200表达的降低而显著降低，FAK活性明显增高，同时此FIP200表达的降低显著增强细胞活性，促进细胞增殖. 以上结果提示,在细胞信号传导通路中FIP200是作为FAK的抑制剂而起作用的，高表达的FIP200与FAK连接，抑制FAK的活化从而影响到细胞增殖.

　　我们设想CSE可能能够通过影响FIP200的表达从而抑制气道上皮细胞的增殖，因此我们检测了CSE干预后的气道上皮细胞FIP200表达以及FIP200与FAK的连接情况，结果显示：CSE能够显著促进FIP200的表达，增强FIP200与FAK的连接，并且此影响呈CSE干预时间和干预浓度依赖性；CSE对气道上皮细胞增殖的抑制和对细胞增殖周期的阻滞均与FIP200表达和FIP200与FAK的连接成正相关. 以上结果都支持：CSE能够通过促进FIP200的表达抑制气道上皮细胞增殖，从而影响气道上皮的损伤修复.

　　【】

　　［1］ Anne LH, Denis P, Jocelyne H, et al. Fibronectin and its α5β1integrin receptor are involved in the woundrepair process of airway epithelium［J］. Am J Physiol, 1996;271(5 Pt 1):L726-L733.

　　［2］ Zahm JM, Kaplan H, Herard AL, et al. Cell migration and proliferation during the in vitro wound repair of the respiratory epithelium［J］. Eur Respir J, 1995;19（8 Suppl）: 1375.

　　［3］ Akamura Y, Romberger DJ, Tate L, et al. Cigarette smoke inhibits lung fibroblast proliferation and chemotaxis［J］. Am J Respir Crit Care Med, 1995;151:1497-1504.

　　［4］ Salazar EP, Rozengurt E. Src family kinases are required for integrinmediated but not for G proteincoupled receptor stimulation of focal adhesion kinase autophosphorylation at Tyr397［J］. J Biol Chem, 2001; 276:  17788-17795.

　　［5］ Yoshiko S, Yaeko M, Megumi F, et al. Antiapoptotic role of focal adhesion kinase (FAK) ［J］. J Biol Chem, 2000; 275: 16309-16315.

　　［6］ Grant1 MB, Caballerol S, Kornberg L, et al. Focal adhesion kinase (FAK) overexpression modulates retinal angiogenesis ［J］. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2003;44: EAbstract 557.

　　［7］ Smita A, Hiroki U, Zheng CH, et al. Regulation of focal adhesion kinase by a novel protein inhibitor FIP200［J］. Mol Biol Cell, 2002; 13 (9): 3178-3191.