重组人血管抑素表达载体的构建及在人肝癌细胞系中的表达

【关键词】  ,血管抑制素类

    Construction of recombinant human angiostatin expression vector and stable expression on human hepatocelluar cancer cells

　　【Abstract】 AIM:  To construct the recombinant human angiostatin (hANG) expression vector and to detect its expression in hepatocellular carcinoma cells. METHODS:  hANG cDNA fragment was obtained by RTPCR from human embryonic tissue and the fragment was cloned into pCRBlunt IITOPO vector and into pcDNA3.1 (+) expression vector. Colony PCR, restriction enzyme digestion and sequencing were used to verify the obtained hANG cDNA fragment. The recombinant pcDNA3.1hANG plasmid was then transfected into hepatocellular carcinoma cells to detect the expression of hANG in these cells. RESULTS:  The  obtained hANG fragment (1.1 kb) was identical to the sequence of reported human angiostatin. Restriction enzyme digestion demonstrated that the recombinant pcDNA3.1hANG expression vector was successfully constructed. The transfected SMMC7221 cells successfully expressed hANG. In addition, no difference in the growth speed was observed between the untransfected SMMC7221 cells, the SMMC7221 cells transfected with pcDNA3.1(+) vector and the SMMC7211 cells transfected with recombinant pcDNA3.1hANG. CONCLUSION:  We have successfully constructed the recombinant pcDNA3.1hANG expression vector and obtained SMMC7221 cells that can stable express hANG.

　　【Keywords】 angiostatins; carcinoma, hepatocellular; angiogenesis; expression vector

　　【摘要】 目的： 构建重组人血管抑素（hANG）的表达载体并检测其在肝癌细胞系中的稳定表达. 方法： 利用RTPCR从人胚胎肝组织中扩增出hANG cDNA片段，将其克隆到pCRBlunt IITOPO载体和pcDNA3.1(+)表达载体，利用克隆PCR、限制性内切酶消化以及序列测定对获得的hANG基因片段及重组载体进行验证. 将重组pcDNA3.1hANG真核表达载体转染到人肝癌细胞SMMC7721对其表达状况进行检测. 结果： 所获得的hANG片段（1.1 kb）序列与报道的序列完全一致. 酶切鉴定的结果表明含血管抑素基因的重组pcDNA3.1hANG表达载体构建成功. 转染重组pcDNA3.1hANG的人肝癌细胞SMMC7721表达了血管抑素. 另外，从生长曲线结果来看，转染pcDNA3.1hANG真核表达载体和空载体的人肝癌细胞SSMC7721和未转染的SSMC7721细胞的生长速度无明显差别. 结论： 成功地构建了重组人血管抑素真核表达载体并获得能稳定表达人血管抑素的SSMC7721肝癌细胞，为开展下一步的实验奠定了基础.

　　【关键词】 血管抑制素类；癌，肝细胞；血管生成；表达载体
 
　　0引言

　　原发性肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，以往的实验研究多数针对肿瘤细胞本身，但瘤细胞具有遗传不稳定性、高突变率和高异型性等特点，因此未能取得满意的疗效. 肝癌具有双重血液供应系统，是体内最富有血管的肿瘤之一，抗血管生成将为原发性肝癌的治疗提供一个新的途径.
 
　　血管抑素（angiostatin, ANG）是近年来发现的最有效的血管生成抑制因子之一，它特异性地作用于血管内皮细胞，通过抑制血管生成实现抑制肿瘤的生长和转移，是肿瘤基因治疗中非常有用的目的基因［1］. 但是，血管抑素抑制肿瘤血管生长的机制还不清楚. 在既往的实验中我们观察了鼠源性ANG在肝癌细胞系中的表达［2］. 为了使研究结果更贴近临床实际，我们构建了重组人血管抑素（human angiostatin, hANG）表达载体，利用体外实验方法观察了重组hANG在肝癌细胞系中的稳定表达，为将来进一步开展血管抑素抑制肝癌生长的机制研究奠定基础.

　　1材料和方法
 
　　1.1材料

　　pCRBlunt IITOPO载体, pcDNA3.1(+)载体, Trizol,和Superscript II反转录酶购自Invitrogen公司. DNA凝胶回收及质粒提取试剂盒购自Qiagen公司. Taq DNA聚合酶购自Takara公司. PfuTurbo DNA聚合酶购自Stratagene公司. 脂质体转染试剂盒购自Gibco公司. ECL化学发光试剂盒(RPN2109)购自Amersham公司. 人源性肝癌细胞株SMMC7721为本室保存. 引物由上海Sangon公司合成.

　　1.2方法

　　1.2.1PCR扩增hANG基因片段人胚胎肝脏组织取自我校西京妇产科人工流产胚胎，取得患者同意. 组织（约80 mg）取出后，加入1 mL TRIzol试剂按试剂盒说明书提取总RNA. 利用Superscript II反转录酶合成cDNA第1链. 根据报道的hANG的cDNA序列合成上游及下游引物. 上游引物： 5′ TCA GAG TGC AAG ACT GGG AA 3′；下游引物： 5′ ACA GGC GGA GGT GCT ACA AC 3′. 扩增产物长度为1100 bp，包含人纤溶酶原（plasminogen）的Kringle14区［3］. 用PfuTurbo DNA聚合酶及特异性的引物扩增hANG DNA片段，用琼脂糖凝胶电泳检测.
 
　　1.2.2重组pCRBlunt IIhANG质粒的构建用QIAquick凝胶回收试剂盒回收DNA片段，利用T4 DNA连接酶将hANG片段与pCRBlunt IITOPO载体连接. 连接产物转化E.coli DH5α，并涂布于培养平板. 随机挑选若干个菌落，用Taq DNA聚合酶及hANG引物进行PCR扩增. 选取几个经克隆PCR检测阳性的菌落，小量制备质粒，进行DNA测序.

　　1.2.3重组pcDNA3.1hANG表达载体的构建对测序正确的pCRBlunt IIhANG质粒以及pcDNA3.1(+) 载体进行KpnⅠ和XhoⅠ双酶切，凝胶电泳检测，用Qiagen凝胶回收试剂盒回收hANG片段和酶切的pcDNA3.1(+) 载体. T4 DNA连接酶连接上述得到的hANG片段和pcDNA3.1(+) 载体，连接产物转化E.coli DH5α. 随机挑选6个菌落，小量提取质粒，用KpnⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定.

　　1.2.4pcDNA3.1hANG基因转染SMMC7721细胞复苏液氮中保存的人肝癌细胞系SMMC7721取出后，用含200 mL/L血清的RPMI1640培养基于37℃ CO2孵箱培养；将培养的SMMC7721细胞以大约1×107/L的密度接种于6孔培养板上，于37℃ CO2孵箱培养过夜. 细胞贴壁生长后加入不同浓度的G418. G418分别取浓度为0, 100, 200, 350, 500和650 g/L. 隔2 d换液，选取7～10 d内杀死SMMC7721细胞的最低G418浓度为筛选浓度. 当细胞生长融合度达70%~80%时，按脂质体转染试剂盒操作进行转染. 细胞分为三组：  pcDNA3.1hANG为转染组，pcDNA3.1（+）质粒为空载体对照组，未转染的SMMC7721细胞为空白对照组. 转染后的细胞继续进行培养，当细胞再次贴壁后，加入350 g/L G418进行筛选，每3 d换液1次. 2 wk后分别挑选出阳性细胞克隆扩增培养.
 
　　1.2.5细胞生长速度测定将处于对数生长期的三组细胞（SMMC7721,SMMC7721/pcDNA3.1（+）,SMMC7721/pcDNA3.1hANG）调整细胞数为2×107/L，分别接种于24孔细胞培养板常规培养，以后每日取三孔计数，观察8 d，绘制细胞生长曲线.
 
　　1.2.6用RTPCR检测hANG DNA在SMMC7721细胞中的表达按前述方法提取各组细胞的总RNA，用RTPCR检测hANG在细胞中的表达.
 
　　1.2.7用Western blot检测hANG DNA在SMMC7721细胞中的表达将生长良好的经pcDNA3.1hANG转染及正常的SMMC7721细胞各约2×108个接种至200 mL培养瓶中，用无血清培养基培养5 d，收集细胞上清后加入裂解缓冲液匀浆，提取蛋白质，-70℃保存. 取30 μg蛋白，行聚丙烯酰胺凝胶电泳，并将蛋白质电转印至PVDF膜. 用山羊抗hANG多克隆抗体（0.1 g/L）室温孵育过夜. TBST洗膜后，再加入辣根过氧化物酶标记的驴抗山羊IgG（1∶5000），室温孵育2 h. 用ECL化学发光试剂盒显色剂进行检测.

　　2结果

　　2.1重组pcDNA3.1hANG表达载体的构建

　　2.1.1hANG基因片段的获得用RTPCR方法从人胚胎肝脏组织扩增出一条长度为1100 bp的片段（Fig 1），其大小与从hANG特异性引物推导出的扩增产物的大小一致.

　　2.1.2重组pCRBlunt IIhANG的克隆PCR鉴定将PCR获得的hANG片段从凝胶回收后，插入到pCRBlunt IITOPO载体中，经含卡那霉素的LB平板筛选后，选取16个菌落，利用hANG引物进行克隆PCR检测. 在16个选取的菌落中有10个呈阳性（Fig 2）.

　　2.1.3重组pCRBlunt IIhANG质粒的酶切鉴定选取4个克隆PCR检测阳性的菌落（6, 7, 9, 14号，Fig 2），培养后，小量提取质粒DNA，用限制性内切酶KpnⅠ和XhoⅠ双酶切. 4个克隆均被酶切出两条条带，大小为3.5 kb和1.1 kb. 前者为pCRBlunt IITOPO载体，后者为hANG cDNA片段（Fig 3）.

　　2.1.4序列测定第2和第3号重组pCRBlunt IIhANG质粒DNA进一步进行测序（Fig 3），结果表明hANG基因片段以正确的方向插入到了pCRBlunt IITOPO载体中，测得的序列与报道的hANG cDNA序列完全相同（结果未显示）.

　　2.1.5重组pcDNA3.1hANG表达载体的构建用限制性内切酶KpnⅠ 和XhoⅠ分别对重组pCRBlunt IIhANG质粒和pcDNA3.1(+)载体酶切，将回收的hANG cDNA片段和酶切后的pcDNA3.1(+)载体进行连接. 对获得的重组pcDNA3.1hANG质粒进行KpnⅠ和XhoⅠ的双酶切鉴定. 三个克隆的质粒均被酶切出大小为5.4 kb和 1.1 kb的两个条带，分别为pcDNA3.1(+)载体和hANG cDNA片段（Fig 4）.

　　2.2hANG cDNA在人肝癌细胞SMMC7721中的表达

　　2.2.1hANG cDNA真核转染后细胞筛选用脂质体法转染重组质粒pcDNA3.1hANG及空载体pcDNA3.1(+)于人肝癌细胞SMMC7721，用含350 g/L G418的培养液筛选培养，每3日换液一次，第5 日细胞开始出现死亡，第8 日后空白对照组细胞基本死亡，2 wk后即可见抗性克隆出现，继续筛选，待细胞扩增后移至培养瓶扩大培养，光镜下见转染后细胞与正常细胞的形态无明显差别.
 
　　2.2.2细胞生长曲线用不含G418的常规培养基培养pcDNA3.1hANG, pcDNA3.1(+)转染的SMMC7721细胞及未转染SMMC7721细胞，计数后绘制生长曲线，结果表明三组细胞的生长速度无明显差异（Fig 5）.

　　2.2.3转染hANG基因细胞的RTPCR鉴定结果PCR扩增结果显示转染pcDNA3.1hANG并筛选后的SMMC7721细胞可扩增出约1.1 kb大小的片断，空载体和正常细胞未扩增出片段（Fig 6），结果表明重组质粒pcDNA3.1hANG已成功转染入人肝癌SMMC7721细胞.

　　2.2.4转染hANG基因细胞的Western blot检测Westernblot结果显示用羊抗人血管抑素多克隆抗体在转染pcDNA3.1hANG的细胞上清中有Mr为38×103的蛋白条带，转染空载体的细胞和正常细胞中未检测到阳性条带（Fig 7），表明血管抑素基因在肝癌细胞内得到表达和分泌.

　　3讨论
 
　　目前已经明确实体肿瘤的生长和转移具有血管依赖性，应用抗血管生成方法肿瘤已引起了广泛的关注与研究［4，5］. 血管抑素是近年来发现的一种新的血管生成抑制剂［1］. 大量的研究已经表明，血管抑素能显著抑制肿瘤血管内皮细胞的生长，使原发和转移瘤处于休眠状态，从而抑制肿瘤生长，被认为是最有前途的肿瘤生长抑制剂之一［6-8］.

　　分子生物学的研究表明血管抑素是纤溶酶原的一个内部片段，其N端始于纤溶酶原氨基酸残基Val79，C端是Thr440，包括纤溶酶原前4个由二硫键连接，具有三维环状结构的kringle活性区. 血管抑素蛋白kringle14活性区的血管抑制活性存在较大差异. 主要的抑制功能区在kringle13，而kringle4几乎无抑制作用［3］.
 
　　本实验中，我们利用高保真的PfuTurbo DNA聚合酶从人胚胎肝组织中扩增出血管抑素的kringle1 4基因片段，长度为1100 bp，将其克隆到pCRBlunt IITOPO载体，利用克隆PCR，限制性内切酶消化以及序列测定对获得的hANG基因片段进行了验证，结果表明所获得的hANG序列与报道的序列完全一致. 进一步采用双酶切位点KpnⅠ, XhoⅠ将hANG基因片段克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+)，经酶切鉴定进行筛选，获得了阳性克隆，表明含血管抑素基因的真核表达载体构建成功.
 
　　为了验证人血管抑素基因能否在真核细胞中有效表达，我们将重组的pcDNA3.1hANG真核表达载体转染到人肝癌细胞SMMC7721中. 本研究采用的是转染效率高、操作简便、稳定性好、安全无毒的脂质体转染方法. 首先进行预试验，通过一系列G418浓度对人肝癌细胞SSMC7721的杀伤试验，确定了G418的合适筛选浓度，即7～10 d内完全杀死SSMC7721细胞的最低G418浓度为350 mg/L，G418可通过干扰核糖体的功能而阻断哺乳动物细胞的蛋白质合成，而neo抗性基因则可使G418失活，真核表达载体pcDNA3.1(+)上含neo编码基因，因此转染成功的真核细胞可对G418产生抗性. 转染时设空载体作对照，同时为了提高重组效率，将真核表达质粒酶切后线性化，再转染细胞，通过G418筛选2 wk获得抗G418的耐药细胞株. 经逆转录PCR鉴定表明，质粒DNA已稳定地整合进细胞基因组中. 再用Westernblot检测其表达产物，结果有Mr为38×103的条带出现，表明在真核细胞SSMC7721中成功地表达了血管抑素. 另外，从生长曲线结果来看，转染pcDNA3.1hANG真核表达载体和空白载体的SSMC7721肝癌细胞及未转染的人肝癌细胞SSMC7721的生长速度无明显差别，表明人血管抑素对人SMMC7721肝癌细胞本身的生长无抑制作用，但转染重组hANG表达载体的肝癌细胞可以分泌血管抑素蛋白. 因此通过上述实验，我们成功地构建了重组人血管抑素真核表达载体并获得能稳定表达人血管抑素的SSMC7721肝癌细胞，为开展下一步的试验奠定了基础.

　　【】

　　［1］ Cao Y, Xue L. Angiostatin  ［J］. Semin Thromb Hemost, 2004; 30 (1): 83-93.

　　［2］ 陶开山，吴兴安，窦科峰. 鼠源性血管抑素cDNA在人肝癌细胞SMMC7721中的稳定表达及意义［J］. 第四军医大学学报, 2001; 22 (17): 1594-1598.

　　Tao KS, Wu XA, Dou KF. Stable expression and significance of murine angiostatin cDNA in the human hepatocellular carcinoma cells SMMC7221 ［J］. J Fourth Mil Med Univ, 2001; 22 (17): 1594-1598.

　　［3］ Cao Y, Ji RW, Davidson D, et al. Kringle domains of human angiostatin. Characterization of the antiproliferative activity on endothelial cells ［J］. J Biol Chem, 1996; 271 (46): 29461-29467.

　　［4］ OReilly MS, Holmgren L, Shing Y, et al. Angiostatin: A novel angiogenesis inhibitor that mediates the suppression of metastases by a Lewis lung carcinoma ［J］. Cell, 1994; 79 (21): 3l5-328.

　　［5］ Agarwal A, MunozNajar U, Klueh U, et al. Nacetylcysteine promotes angiostatin production and vascular collapse in an orthotopic model of breast cancer ［J］. Am J Pathol, 2004; 164(5): 1683-1696.

　　［6］ Kim KS, Kim HS, Park JS, et al. Inhibition of B16BL6 tumor progression by coadministration of recombinant angiostatin K13 and endostatin genes with cationic liposomes ［J］. Cancer Gene Ther, 2004; 11(6): 441-449.

　　［7］ Seidlitz E, Korbie D, Marien L, et al. Quantification of antiangiogenesis using the capillaries of the chick chorioallantoic membrane demonstrates that the effect of human angiostatin is agedependent ［J］. Microvasc Res, 2004; 67(2): 105-116.

　　［8］ Kirsch M, Schackert G, Black PM. Metastasis and angiogenesis ［J］. Cancer Treat Res, 2004; 117 (2):285-304.