糖皮质激素致星形胶质细胞内钙浓度的快速升高
【关键词】 应激；糖皮质激素；星形细胞；钙
Rapid elevation of intracellular free calcium concentration in astrocytes after treated by glucocorticoid
【Abstract】 AIM: To explore the mechanisms of glucocorticoid (GC) leading to the elevation of intracellular free calcium concentration (［Ca2+］i) in astrocytes in early effect phase. METHODS: A cell culture model of neonatal Wistar rat hippocampal astrocytes was used. After exposed to corticosterone (CORT) (1 μmol/L), NmethylDaspartate (NMDA), MK801 and BSACORT, respectively, changes of ［Ca2+］i in astrocytes were observed by laser confocal microscope. RESULTS: CORT induced rapid elevation of intracellular Ca2+ fluorescence intensity within 10 min （177.1±3.8， P<0.01) compared with controls (141.2±4.7), but induced no significant change when there was no Ca2+ out of the cell （148.5±6.3). NMDA caused further increase of intracellular Ca2+ after pretreatment with CORT (195.3±7.2， P<0.01). MK801 partially suppressed the prolonged intracellular Ca2+ elevation (186.4±1.8). BSACORT had almost the same effect as the CORT treatment （200.7±12.2, P<0.01). CONCLUSION: The rapid effect of GC induces significant ［Ca2+］i elevation in astrocytes during stress, and maybe NMDA receptor involves in this process.
【Keywords】 stress; glucocorticoid; astrocytes; calcium
【摘要】 目的：研究应激水平的糖皮质激素（GC）在早期快速效应中对星形胶质细胞内游离Ca2+浓度（［Ca2+］i）的影响及作用机制. 方法：原代培养新生Wistar大鼠海马星形胶质细胞，用1 μmol/L的皮质酮(CORT)处理星形胶质细胞，激光共聚焦显微镜下观察CORT快速作用致星形胶质细胞内游离［Ca2+］i的变化，并设立N甲基D天冬氨酸(NMDA)，受体拮抗剂5甲基二氢丙环庚烯亚胺马来酸(MK801)，牛血清白蛋白偶联CORT （BSACORT）及无细胞外钙等干预组,进一步检测［Ca2+］i变化. 结果：与未处理对照细胞（141.2±4.7）相比，CORT可快速介导星形胶质细胞内荧光强度增加（177.1±3.8， P<0.01)，但细胞外钙为零时无明显变化（148.5±6.3）；NMDA受体激活可使荧光强度进一步增强(195.3±7.2，P<0.01)，NMDA受体拮抗剂MK801可部分拮抗荧光强度升高(186.4±1.8)；BSACORT可产生与CORT类似的效应（200.7±12.2，P<0.01). 结论：应激水平的GC在早期可快速增加星形胶质细胞胞内［Ca2+］i，激活NMDA受体是其中的重要机制之一.
【关键词】 应激；糖皮质激素；星形细胞；钙
星形胶质细胞作为中枢神经系统（central nervous system, CNS）内数量最多的细胞，广泛参与CNS内信息的处理与传导，并在神经退行性疾病、脑老化及外伤、炎症等病变的发生中扮演重要角色［1］. 糖皮质激素（glucocorticoid，GC）发挥作用可通过早期（30 min以内）的非基因组效应和后期的基因组效应［2］. 有报道，GC的基因组效应可增加星形胶质细胞胞内游离Ca2+浓度（［Ca2+］i［3］，Ca2+作为重要的胞内信使，对细胞功能、信号传递及神经递质释放具有重要意义. 目前关于应激时GC对星形胶质细胞的作用机理，尤其是GC的非基因组效应对星形胶质细胞［Ca2+］i的影响少见报道. 本实验选用应激浓度的皮质酮(corticosterone, CORT)，应用激光共聚焦显微镜观察星形胶质细胞内早期Ca2+水平的变化，初步探讨应激情况下GC非基因组作用阶段对Ca2+的影响及机制.
1材料和方法
1.1材料出生2 d以内的新生近交系Wistar大鼠，由第三军医大学实验动物中心提供; IMDM培养基(美国Gibco公司)；胎牛血清(天津TBD公司）；胰蛋白酶和EDTA(美国Amresco公司)；生物素标记抗大鼠胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acid protein, GFAP)mAb(北京中山生物技术公司）；藻红蛋白(Phycoerythrin, PE)标记链霉亲和素（美国eBioscience公司）；CORT，N甲基D天冬氨酸(NmethylDaspartate, NMDA)和其受体拮抗剂5甲基二氢丙环庚烯亚胺马来酸(MK801)，牛血清白蛋白偶联CORT(BSACORT)(美国Sigma公司)；Fluo3/AM和pluronic F127(美国Molecular Probes公司)；XTL3A型解剖显微镜（江苏镇江仪器厂）；DM IRB型荧光显微镜和TCSNT激光共聚焦显微镜(德国Leica公司).
1.2方法
1.2.1大鼠星形胶质细胞的原代培养及鉴定无菌条件下取出大鼠双侧海马，置于4℃的0.01 mol/L PBS缓冲液中，在解剖显微镜下剥除脑膜及血管，剪碎后用2.5 g/L的胰酶和等体积1 mmol/L的EDTA在37℃消化20 min，终止消化后吸管吹打，100目筛网机械过滤，制备为混合细胞悬液，离心收集沉淀，将细胞密度调至5×107个/mL，加至铺被了多聚赖氨酸的塑料培养瓶中. 第2日换液去除死亡细胞碎片，不换液继续培养5～6 d，置于37℃恒温摇床中180 r/min振摇12～15 h，去除上清中的小胶质细胞和少突胶质细胞，余下贴壁的为星形胶质细胞. 将细胞接种在无菌培养皿内的盖玻片上，24 h后采用间接免疫荧光法进行单层细胞染色，GFAP呈阳性确定为星形胶质细胞. 用荧光显微镜在200倍视野下随机计数200个细胞，阳性细胞百分率.
1.2.2CORT对星形胶质细胞［Ca2+］i的影响当接种于盖玻片上的细胞融合至80%时换用无血清培养基培养24 h，实验随机分为五组：①未处理对照组；②1 μmol/L CORT处理10 min组；③外钙为零时1 μmol/L CORT处理10 min组；④1 μmol/L CORT 10 min+100 μmol/L NMDA 12 min＋10 μmol/L MK801 8 min处理组；⑤1 μmol/L BSACORT处理10 min组. 其中第③组用无Ca2+和Mg2+的DHanks液清洗细胞3次，再用DHanks液配制Fluo3/AM(1 μmol/L)和20 % (W/V)的F127加于细胞上, 使荧光探针均匀分布于细胞，在37℃的CO2培养箱内避光负载30 min. 然后用DHanks液轻洗细胞3次去除未进入细胞内的荧光探针, 其他4组中的DHanks液均用无Mg2+但含Ca2+的平衡盐溶液(130 mmol/L NaCl, 5.4 mmol/L KCl, 2.0 mmol/L CaCl2, 5.5 mmol/L glucose, 10 μmol/L glycine, 10 mmol/L Hepes, pH=7.3)代替. 在激光共聚焦显微镜下动态扫描细胞内荧光强度变化（激发波长488 nm，发射波长530 nm），以间隔12 s的速度扫描，记录不同时间细胞内［Ca2+］i浓度变化某一层面的荧光图像. 待细胞内［Ca2+］i达到稳态后，按以上的干预因素进行分组实验. 由Leica TCS图像分析系统对所选取细胞的平均荧光强度进行数据采集，画出其随时间变化的曲线. 由于Fluo3结合钙离子后其荧光强度与细胞内游离钙离子浓度成正比, 因此取每个细胞荧光强度测定值平均数表示该细胞内游离钙离子浓度, 每个处理组随机选择6个细胞动态扫描细胞内［Ca2+］i的荧光强度,取平均值.
统计学处理: 所有计量资料以x±s表示，采用SPSS 10.0软件的OneWay ANOVA进行统计学分析, 选用LSDt检验法完成组间比较.
2结果
2.1原代星形胶质细胞的纯度鉴定体外原代培养星形胶质细胞，在显微镜下呈单层生长，互不重叠. 采用间接免疫荧光法检测星形胶质细胞的特征性抗原GFAP，结果显示表达阳性率>95%. 提示所分离的星形胶质细胞纯度高（图1）. 图1间接免疫荧光法鉴定培养的海马星形胶质细胞纯度×200
2.2CORT处理星形胶质细胞引起细胞内钙的动态变化荧光指示剂Fluo3与游离钙结合后，在激光共聚焦显微镜下可见处理前星形胶质细胞内较低的荧光强度（141.2±4.7），加入1 μmol/L CORT处理10 min星形胶质细胞内荧光强度有显著增强（177.1±3.8， P<0.01，图2）. 但外钙为零时，荧光强度无明显变化（148.5±6.3），差异无统计学意义. 说明CORT诱导星形胶质细胞内钙升高是以外钙内流为主而非内钙释放（图3）.
2.3CORT处理星形胶质细胞及NMDA，MK801A: 未处理对照组; B: 1 μmol/L CORT处理10 min组.
2.4BSACORT处理星形胶质细胞引起细胞内钙的变化结果显示，加入1 μmol/L BSACORT处理星形胶质细胞，细胞内荧光强度明显增强（200.7±12.2），影响具有显著性（P<0.01，图5).
3讨论
星形胶质细胞在CNS内的代谢、营养、支持、调节突触等活动中发挥重要作用. GC的急性升高一方面可能通过快速效应直接损伤神经元的功能；另一方面，GC对星形胶质细胞的快速作用间接损伤神经元的功能.
本实验选择星形胶质细胞的内钙变化作为效应指标，观察其动态变化的过程. 由于星形胶质细胞的A: 未处理对照组; B: 1 μmol/L BSACORT处理10 min组.图5BSACORT处理星形胶质细胞引起细胞内钙变化
内钙升高主要有两种途径：①外钙内流；②内钙释放. 实验中用1 μmol/L应激浓度的CORT处理星形胶质细胞可引起细胞内钙明显升高, 但外钙为零时无此效应, 说明CORT诱导的外钙内流是星形胶质细胞内钙升高的重要原因. 由于GC的升高引起谷氨酸的释放增加［4］，谷氨酸通过多种途径影响星形胶质细胞内钙信号，激活NMDA受体是其中的重要机制之一［5］，且NMDA受体是影响星形胶质细胞功能的重要通路［6-7］，我们为观察NMDA受体在GC快速诱导星形胶质细胞内钙升高中的作用，明确GC引起星形胶质细胞内钙升高的外钙内流机制，先用CORT处理10 min， 加入100 μmol/L NMDA作用12 min激活其受体, 结果NMDA单独也可快速介导星形胶质细胞内钙升高, 并对CORT诱导星形胶质细胞内钙升高有协同作用, 说明NMDA受体参与了CORT引起的细胞内钙升高, 但同时MK801只部分抑制了内钙升高，提示CORT可能存在其它途径作用于钙信号.
由于BSACORT分子量大，不能穿透细胞膜，所以BSACORT是通过非基因组效应结合细胞膜上的作用位点发挥快速作用. BSACORT产生了与CORT类似的效应，进一步表明CORT诱导的星形胶质细胞内钙升高是由GC的快速非基因组效应介导的.
本研究结果从不同侧面提示GC快速升高星形胶质细胞内钙属非基因组效应，从而揭示了GC快速效应和星形胶质细胞功能之间可能存在的关系, 以及GC存在非基因组效应的功能意义，为进一步研究GC对星形胶质细胞和神经元功能的调节提供依据.
【】
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