两种方法制备水飞蓟宾固体脂质纳米粒的比较
【关键词】 水飞蓟宾；固体脂质纳米粒；超声学；高压乳匀法
Comparative studies of silibinin contained solid lipid nanoparticles prepared by two methods
【Abstract】 AIM: To evaluate the potential of the preparatory methods of solid lipid nanoparticles (SLN) carrying silibinin (SIL) extracted from traditional Chinese medicinal herbs, and to study the physicochemical characteristics of the SILSLN produced by 2 different methods. METHODS: SILSLN was prepared by ultrasonication or high pressure homogenization. Transmission electron microscopy was employed to study the shape. Particle characterization system and zeta potential analyzer were used to study the particle diameter and zeta potential of SLN in suspension. The entrapment efficiency was determined by sephadex gel chromatography and highperformance liquid chromatography (HPLC). The stability of SLN was also studied. RESULTS: The SILSLN prepared by ultrasonication was plateletshaped and irregular, and the SILSLN prepared by high pressure homogenization was spherical and regular in shape. The particle diameters of SILSLN prepared by ultrasonication and high pressure homogenization were (165±7) nm and (157±6) nm separately (P<0.05). The Zeta potentials were (-28.35±2.72) mv and (-35.36±2.68) mv separately (P<0.001). The entrapment efficiencies were (90.59±0.89)% and (95.64±1.33)% (P＜0.001) separately. SILSLN prepared by high pressure homogenization showed sufficient longterm stability with only slight particle growth (P>0.05) after storage at room temperature for 4 weeks. CONCLUSION: High pressure homogenization is demonstrated to be a more suitable method than ultrasonication to prepare the smaller, steadier and highly incorporated SILSLN.
【Keywords】 silibinin; solid lipid nanoparticles; ultrasonics; high pressure homogenization
【摘要】 目的：探索将中药水飞蓟宾（SIL）制备成固体脂质纳米粒（SLN）的方法，并探讨SILSLN的主要性质. 方法：分别采用超声法和高压乳匀法制备SILSLN. 在电镜下观察其形态，以Mastersizer 2000粒度分析仪和Zetasizer Nano电位分析仪测定其粒径和Zeta电位，以葡聚糖凝胶柱层析法和HPLC测定其包封率，并观察SLN的稳定性. 结果：超声法制备的SILSLN在透射电镜下呈片状存在，形态不规则，高压乳匀法制备的SILSLN呈球状，形态规则. 超声法和高压乳匀法制备的SILSLN粒径分别为(165±7) nm和(157±6) nm (P<0.05)； Zeta电位分别为(-28.35±2.72) mv和(-35.36±2.68) mv (P<0.001)； 包封率分别为(90.59±0.89)%和(95.64±1.33)% (P<0.001). 高压乳匀法制备的SILSLN室温放置4 wk后，粒径无明显增加(P>0.05). 结论：高压乳匀法制备SILSLN具有粒径小、稳定性和包封率高的特点，优于超声法.
【关键词】 水飞蓟宾；固体脂质纳米粒；超声学；高压乳匀法
固体脂质纳米粒（solid lipid nanoparticles, SLN）是在20世纪90年代初起来的一种可替代乳剂、脂质体和聚合纳米粒的新型胶体给药系统［1］. 固体脂质纳米粒以固态的天然或合成的类脂为载体，将药物包载于类脂中制成，平均粒径约50～1000纳米. 它所含有的固体脂质成分是机体可利用、可生物降解的，与聚合纳米粒相比，它的毒性更低，由于药物被包封在固体脂粒的骨架中，不存在药物在贮存过程中的泄漏问题，具有缓释、控释和靶向作用［2-3］. 静脉给药后，很快被网状内皮系统吞噬而被动进入肝脏，达到肝靶向作用［4］. 水飞蓟是菊科草本植物，其活性成分主要存在于种子中，称水飞蓟素，主要由水飞蓟宾(silibinin or silybin, SIL)、水飞蓟宁、水飞蓟亭等同分异构体组成. 在水飞蓟素中，SIL含量最多，活性也最高［5］. 由于SIL难溶于水，生物利用度低，国内外都在积极研制SIL的新剂型，以提高其生物利用度. 本研究利用超声法和高压乳匀法分别制备水飞蓟宾固体脂质纳米粒（SILSLN），并比较了两种方法制备的SILSLN的不同.
1材料和方法
1.1材料SIL（纯度95％，盘锦格林恩生物资源开发有限公司）；豆磷脂（北京奥博星生物技术责任有限公司）；硬脂酸（天津市天大化学试剂厂）；葡聚糖凝胶G50（天津化学制剂二厂）；无水乙醇（西安化学试剂厂）；甲醇（天津市科密欧化学试剂开发中心，HPLC纯）；蒸馏水（自制一级水，三级水）；甘油（厦门甘油厂）. Mastersizer 2000 粒度分析仪（英国马尔文公司）；Zetasizer Nano电位分析仪（英国马尔文公司）；LC2010高效液相色谱仪（日本岛津公司）；JY 92II超声细胞粉碎机（宁波新芝科器研究所）；APV2000高压乳匀机（丹麦APV公司）；H600透射显微镜（日本Hitachi公司）；BP121S型电子天平（德国sartorius公司）；852恒温磁力搅拌加热器（国华电器有限公司）；U2000型紫外扫描仪（上海光华仪器厂）.
1.2方法
1.2.1SILSLN的制备经过单因素考察和正交实验设计优化，确定较优制备工艺为：精密称取1.5 g硬脂酸,1.0 g豆磷脂和SIL 75 mg，在70℃水浴中溶解于10 mL无水乙醇中，形成有机相溶液. 量取45 mL甘油分散于75 mL蒸馏水中形成水相. 将水相置于恒温磁力搅拌器上，温度为80℃，将有机相注入水相中，搅拌2 h，使成乳白色混悬液，形成初乳. 按以下两种方法分别处理：①超声法：将上述初乳超声处理300 s，搅拌至室温，用0.45 μm微孔滤膜过滤除去超声探头释放的钛颗粒等杂质，得SILSLN水分散体，4℃密封保存. ②高压乳匀法：在高压乳匀机上50 MPa乳匀5次，即得SILSLN，4℃密封保存.
1.2.2电镜观察取一滴SILSLN滴加至铜网上，用20 g/L磷钨酸负染30 s，在透射电镜下观察并拍摄照片.
1.2.3粒径及Zeta电位的测定取SILSLN适量，蒸馏水稀释20倍后，用粒度分析仪和电位分析仪分别测定所制备的SLN的粒径和Zeta电位. 按照上述超声法和高压乳匀法各制备9份样品，平均粒径和Zeta电位（n=9）.
1.2.4包封率的测定色谱条件色谱柱：Planetsil C18(4.6 mm×15 cm)柱；流动相：甲醇0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(用磷酸调pH 3.0，35∶65)；流速：1.0 mL/min；柱温：40℃；检测波长288 nm.
将SIL甲醇对照品储备液用流动相稀释成浓度为0.055，0.222，0.887，3.547，14.188，28.375，56.750，113.500 μg/mL，照上述色谱条件进行测定. 以SIL质量浓度(C)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标进行线性回归分析，判断线性关系.
精密量取SILSLN水分散体0.5 mL，用流动相定容至5.0 mL，测定其中SIL含量（W1）. 移取SILSLN 0.5 mL上样于填充好的Sephadex凝胶柱，以蒸馏水为洗脱剂，接取其中带有白色乳光的部分,定容至5 mL，应用HPLC测定其中SIL含量（W2）. 包封率按以下公式计算：包封率(%)=W2/W1×100%.
1.2.5稳定性SILSLN在室温条件下保存4 wk后测定粒径，以判断其稳定性.
统计学处理：实验计量资料以x±s表示. 两组间差异采用Students t检验，峰面积与药物浓度间关系分析用线性回归进行处理，以P<0.05表示差异有统计学意义.
2结果
2.1外观按照上述两种方法制得的SILSLN水分散体，其外观性状均为带乳白色光泽液体.
2.2电镜观察超声法制备的SILSLN呈片状，不规则，粒子大小不均匀. 高压乳匀法制备的SILSLN呈球状，形态规则，大小较均匀（图1）.
2.3粒径及Zeta电位的测定超声法和高压乳匀法制备的SILSLN粒径分别为(165±7) nm和(157±6) nm(P＜0.05); Zeta电位分别为(-28.35±2.72) mv和(-35.36±2.68) mv (P<0.001).
2.4包封率的测定SIL浓度在0.055～113.50 μg/mL时，峰面积（A）与药物浓度（C）有良好的线性关系，回归方程为A=3307.1C+9910.2，R2=0.9998. 测定的柱回收率（高）为98.99%，柱回收率（低）为98.49%，柱回收率的平均值为98.96%. 依照上述色谱条件与方法测量，按公式包封率，并分别计算两种方法制备的SILSLN包封率的平均值. 超声法制备的SILSLN包封率为(90.59±0.89)%，高压乳匀法制备的SILSLN包封率为(95.64±1.33)% (P＜0.001).
2.5稳定性室温条件下放置4 wk后，超声法制备的SILSLN粒径为(179±14) nm，与4 wk前比较，粒径增加(P＜0.001)；高压乳匀法制备的SILSLN粒径为(165±9) nm，与4 wk前粒径比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，显示出良好的稳定性.
3讨论
SIL是临床上常用的保肝、抗肝纤维化药物［６］. 国内外都在积极研制SIL的新剂型，以提高其生物利用度，例如制成SIL－葡甲胺盐、环糊精包合物、固体分散体或SIL－磷脂复合物等. 这些新剂型对提高生物利用度都起到一定作用，但都存在不足之处，且不能通过静脉给药. 将SIL制成SLN，可显著提高其生物利用度，增加肝靶向性，提高肝组织药物浓度，且其含有的磷脂成分还能起到抗脂质过氧化、稳定肝细胞膜的作用；另外该剂型可通过静脉、口服等多途径给药，可采用高压乳匀法进行化生产，从而开发出高效的保肝、抗肝纤维化中药水飞蓟制剂，具有其它剂型无法比拟的优势.
制备SLN的方法有高压乳匀法、超声法、微乳法等［1-2］. 超声法是最早用于制备固体纳米分散体的技术，因操作简单而被广泛采用，但在制备过程中存在着粒度分布不均和金属粒子污染等缺点. 我们采用微孔滤膜过滤，可有效除去超声探头释放的钛颗粒等金属粒子杂质. 高压乳匀法是将磷脂或三酰甘油如（三棕榈酸甘油酯、三月桂酸甘油酯等）等加热融化，加入药物，熔融液分散于含有表面活性剂的水相中，然后通过高压乳匀机循环乳化即得. 或者将类脂和药物溶于适当的有机溶剂中，除去有机溶剂，加入表面活性剂的水溶液制成初乳，然后再通过高压乳匀机循环乳化，制成SLN. 与许多制备聚合物纳米粒的方法相比，此法可避免采用对人体有害的附加剂，操作简便，易于控制，适于进行工业化生产. 本研究分别采用高压乳匀法和超声法制备SILSLN，发现两种方法制备的SILSLN外观无明显差异，但通过电镜和粒度分析显示，高压乳匀法制备的SILSLN粒径较小，粒子形态规则，大小较均匀. 室温放置4 wk后，高压乳匀法制备的SLN显示出良好的稳定性，Zeta电位的测定也显示高压乳匀法制备的SILSLN稳定性更高，其包封率也高于超声法制备的SILSLN，因此高压乳匀法优于超声法. 有关SLN的形态结构的研究，始终是国内外研究的热点［7-8］. SLN的形态可为球形，也可与球形明显不同，因为脂质在结晶时更易形成板片状［2］. 以上两种方法制备的SILSLN形态不同，其机制尚待进一步研究.
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