大鼠垂体前叶内神经纤维对LH分泌的兴奋性调节作用

【关键词】  电场刺激；黄体生成素；垂体前叶；神经纤维；卵巢切除术；河豚毒素；大鼠

  　　Excitatory regulative effect of nerve fibers on LH secretion in rat anterior pituitary

    【Abstract】 AIM: To investigate the direct regulative effect of nerve fibers on luteinizing hormone （LH） secretion in rat anterior pituitary. METHODS: Eighty diestrus rats determined by vaginal smear were randomly divided into sham operation (SO) and ovariectomy (OVX) groups. Seven days after operations, the anterior pituitary was harvested and superfused with Krebs solution (KrebsRingerbicabonateBSA buffer, KRBGA) with or without tetrodotoxin (TTX). Electrical field stimulation (EFS) was performed at 10 Hz or 2 Hz for 10 min or 2 min, respectively, and the perfusate was continuously collected every 10 min for 130 min from the time 10 min before EFS and measured for LH by radioimmunoassay. RESULTS: In the anterior pituitary superfused with KRBGA without EFS, LH concentration were in a steady basal level with difference between the 2 groups, (4.8±0.5) IU/L in SO group, and (7.1±1.3) IU/L in OVX group (P<0.05). EFS at 10 Hz for 10 min significantly increased LH secretion in the time 10 min after cease of stimulation, from (4.9±0.1) IU/L to (15.7±0.8) IU/L in SO group and from (7.5±4.7) IU/L to (20.0±1.4) IU/L in OVX group, respectively (P<0.05). However, the effect of the same parameter of EFS was abolished if the TTX was added into the perfusate, and LH concentration decreased to (5.4±0.5) IU/L in SO group and (7.7±0.9) IU/L in OVX group 10 min after cease of stimulation. Other variables of EFS have no effect on LH secretion. CONCLUSION: The nerve fibers in the anterior pituitary may have a direct regulative effect on LH secretion.

    【Keywords】 electrical field stimulation; luteinizing hormone; anterior pituitary; nerve fibers; ovariectomy; tetrodotoxin; rat

    【摘要】 目的：探讨垂体前叶神经纤维对黄体生成素（LH）分泌的神经调节. 方法：阴道涂片筛选出动情间期大鼠80只，随机等分为假手术组（SO）和去卵巢组（OVX），术后7 d处死，取出垂体前叶，用Krebs液或含河豚毒素（TTX）的Krebs液离体灌流，同时施加10 Hz或2 Hz, 时间为10 min或2 min的电场刺激（EFS）. 从施加EFS前10 min开始，每10 min收集灌流液1次，连续收集130 min，放免法检测LH浓度. 结果：Krebs液单纯灌流时，SO组的LH平均浓度为(4.8±0.5) IU/L，OVX组LH平均浓度为(7.1±1.3) IU/L，两组间存在显著差异（P<0.05）. 10 Hz持续10 min的EFS后10 min内两组的LH浓度较基础水平有显著增高. SO组由(4.9±0.1) IU/L升高至(15.7±0.8) IU/L; OVX组由(7.5±4.7) IU/L升高至(20.0±1.4) IU/L（P<0.05）. 而改用含TTX的Krebs液灌流后，同参数的EFS后10 min内LH浓度在SO组和OVX组分别为(5.4±0.5) IU/L和(7.7±0.9) IU/L，提示其分泌被显著抑制. 其余各参数的EFS对LH分泌均无明显影响. 结论：垂体前叶内神经纤维可能对LH的分泌存在直接的调节.

    【关键词】 电场刺激；黄体生成素；垂体前叶；神经纤维；卵巢切除术；河豚毒素；大鼠

     黄体生成素（luteinizinghormone, LH）是由垂体前叶（anterior pituitary, AP）促性腺激素细胞合成和分泌的一种激素，分泌调控传统上认为是下丘脑通过体液途径实现的. 近年来研究表明，哺乳类动物AP内存在P物质（substance P, SP）、降钙素基因相关肽(calcitonin generelated peptide, CGRP)等多种肽能神经纤维［1-2］，且SP免疫反应阳性神经纤维可与促性腺激素细胞形成突触［3］，但这些纤维对LH的分泌是否有直接调节，目前的研究报道较少. 本实验采用离体灌流大鼠AP组织薄片结合电场刺激（electrical field stimulation, EFS）的方法［4-5］，通过观察灌流液中LH的分泌变化，探讨AP神经纤维对LH分泌是否有直接调控作用，为垂体前叶激素分泌的神经－体液双重调节假说提供实验依据.

    1材料和方法

    1.1材料成年雌性SD大鼠80只，体质量200~220 g，由第四军医大学实验动物中心提供. 125I标记LH的放射免疫检测试剂盒为天津协和生物有限公司产品；河豚毒素(tetrodotoxin, TTX)为原中科院上海生理所产品；SEN301型电刺激仪、监视器为日本Nikon Kohden公司产品；FJ2003全自动晶体闪烁计数仪为西安国营262厂产品.

    1.2方法

    1.2.1电场刺激和分组每日作阴道涂片确定其动情周期，待动情周期稳定后，选取动情间期大鼠80只随机等分到假手术(sham operation, SO)组和去卵巢(ovariectomy, OVX)组. 麻醉下，手术暴露SO组大鼠双侧卵巢后即缝合腹腔；OVX组大鼠进行双侧卵巢切除术. 术后7 d处死动物，取出AP，行电场刺激实验. 根据电场刺激频率和强度的不同，SO组40只大鼠随机又分为10个亚组（分别称为SA1~SA5组，SB1~SB5组），每组4只. SA1~SA5组均用Krebs液灌流. 其中SA1组不施加电场刺激；SA2组用10 Hz电场刺激10 min，SA3组用10 Hz电场刺激2 min；SA4组用2 Hz电场刺激10 min；SA5组用2 Hz电场刺激2 min. SB1~SB5组用含1 μmol/L TTX的Krebs液灌流，刺激条件与对应的A1~A5组分别相同. OVX组分组同SO组，分别称为OA1~OA5组和OB1~OB5组.

    1.2.2组织薄片制备和灌流大鼠断头，迅速取出AP. 用自制的多头刀架将AP沿矢状轴切成厚度为0.8 mm的组织薄片，迅速移至灌流小室内，用氧饱和的(含950 mL/L O2和50 mL/L CO2) Krebs液（KrebsRinger bicarbonateBSAbuffer, KRBGA）或含1 μmol/L TTX的Krebs液灌流，流速为1×10-4 L/min. Krebs液的成分(mmol/L): NaCl 119; KCl 4.7; CaCl2 2.5; KH2PO4 1.2; MgSO4 1.2; NaHCO3 25; Glucose 11;另含牛血清白蛋白1 g/L和杆菌肽40 mg/L. 平衡灌流50 min后开始收集灌流液，每10 min收集灌流液1次，连续收集130 min，其中第1次灌流液收集后的10 min期间施加EFS，继续收集灌流液100 min后改用含高钾的Krebs液(mmol/L: NaCl 64.9; KCl 58.8; 余成分同前)灌流10 min，以高钾诱发垂体前叶促性腺激素细胞LH的功能性释放，借以判定所测定的垂体细胞的功能状态，各组各时段收集的样品置-20℃冻存待测.

    1.2.3LH测定按125I标记LH的放射免疫检测试剂盒说明书进行灌流液中LH浓度的测定. LH浓度以IU/L表示.

    统计学处理：数据用x±s表示，采用SPSS 10.0软件进行重复测量设计的方差分析，P＜0.05认为差异有统计学意义.

    2结果

    ① SA1组：未施加EFS，仅Krebs液单纯灌流，整个灌注过程LH一直处于较低的稳定状态，在4.3~5.5 IU/L之间浮动，LH平均浓度为(4.8±0.5) IU/L； ②SB1组：用含TTX的Krebs液灌流对LH基础分泌水平无影响，LH平均浓度为(5.0±0.6) IU/L；③SA2组,SB2组：10 Hz，10 min的EFS后10 min LH分泌显著升高（SA2组），这种作用可被TTX阻断（SB2组）；④SA3~SA5组,SB3~SB5组的LH浓度在其相应参数EFS后与基础水平相比均无显著性变化. ⑤OA1组：未施加EFS，LH浓度在5.0~10.4 IU/L之间波动，平均分泌水平(7.1±1.3) IU/L，较SA1组相比有明显增高（P<0.05）；⑥OA2组,OB2组：10 Hz，10 min的EFS可引发LH分泌的短暂升高（OA2组），这种作用可被TTX阻断（OB2组）； ⑦OA3~OA5组,OB3~OB5组LH浓度在其相应参数EFS后与基础水平相比均无显著性变化. SA2，SB2，OA2和OB2组的LH值变化曲线见图1.

     3讨论

    LH是AP分泌的一种重要的生殖激素，传统观点认为其分泌受到下丘脑促性腺激素释放激素脉冲分泌和性腺甾体激素的负反馈双重调节［6］. 我们研究组以前的工作发现，卵巢切除可增加AP中神经纤维的数量及其与促性腺激素细胞形成的突触的比例［3,7］. 在本实验中为了更加容易监测到EFS对离体垂体LH分泌的影响，我们采用了卵巢切除术后7 d大鼠作为实验动物. 与假手术组的大鼠相比，无论单纯灌流还是施加各种参数的EFS，OVX组灌流液中LH的浓度均明显高于SO组，提示卵巢切除可使垂体前叶LH分泌增加.

    本实验发现，Krebs液灌流的AP组织薄片在10 Hz，10 min的EFS下LH的分泌明显增加，且该效应在用含1 μmol/L TTX的Krebs液灌流时被明显抑制，因而我们认为这种现象主要是电场刺激兴奋了垂体前叶的神经纤维所致. 尽管垂体腺细胞上存在TTX敏感型Na+通道［8］，但它并不与激素的基础分泌有关，促性腺激素（gonadotropin, GTH）分泌主要是由持久型电压门控Ca2+通道引起的，离体培养的促性腺激素细胞受到刺激兴奋后加入TTX并不能抑制GTH的分泌［9］. 因此，我们认为EFS主要是兴奋了神经纤维而介导了LH分泌效应，提示垂体前叶内神经纤维对LH存在直接神经调节.

    以前我们曾报道，AP神经纤维对ACTH的分泌存在神经调节［4-5］，本实验中我们进一步观察到AP神经纤维对LH的分泌也存在直接的神经调节，引起LH分泌的刺激参数与诱发ACTH分泌的刺激参数不同. LH只有在10 Hz，10 min的EFS下才出现了分泌水平的改变，而10 Hz，2 min和2 Hz，10 min或2 min的EFS刺激却没有任何效应，考虑其原因可能是AP内腺细胞膜上递质受体的种类、数量及分布的不同而引起的. 10 Hz高频刺激可引起AP神经纤维末梢释放经典递质和多肽类递质，而2 Hz低频刺激引起经典类递质的释放［10］. LH对低频刺激的不敏感的现象提示我们，AP神经纤维调控LH分泌可能是通过促性腺激素细胞膜上的多肽类受体介导的. 另外，本实验还观察到LH分泌对10 Hz刺激10 min与同频率刺激2 min表现出不同的反应性，说明LH的分泌不仅依赖于刺激频率，还依赖于刺激的时程，这可能与不同刺激方式释放出递质的量有关系. 该实验为AP受神经直接调控提供了初步的实验依据，也使我们对LH的分泌模式增加了一种新的认识. 但是与体液途径相比，垂体前叶内神经纤维的“快速调节”在激素分泌调节中所占的比重及地位尚不明确，还有待我们进一步深入研究.

    【】

    ［1］ Ju G, Liu SJ, Ma D. Calcitonin generelated peptide and Substance Plikeimmunoreactive innervation of the anterior pituitary in the rat ［J］. Neuroscience, 1993, 54: 981-989.

    ［2］ 孟繁东，鞠躬. 大鼠垂体前叶GAP43样阳性神经纤维与腺细胞之间的关系［J］. 第四军医大学学报, 2004, 25(10): 887-889.

    ［3］ Liu YY, Morris JF, Ju G. Synaptic relationship of Substance Plike immunoreactive nerve fibers with gland cells of the anterior pituitary in the rat ［J］. Cell Tissue Res, 1996, 285: 227-234.

    ［4］ Gao LZ, Ju G. Dual excitatory and inhibitory effects of stimulation of intrinsic innervation of the anterior pituitary on adrenocorticotropic hormone release in the rat ［J］. J Neuroendocrinol, 2004, 16: 5-9.

    ［5］ Gao LZ, Zhang WH, Ju G. Suppression of adrenocorticotricotropic hormone release by stimulation of the nerve fibres in the anterior pituitary ［J］. J Neuroendocrinol, 2000, 12: 753-757.

    ［6］ 杨增明，孙青原，夏国良，等. 生殖生物学［M］. 北京：出版社，2004：325-360.

    ［7］ 魏晓燕，刘津平，贾轶，等. 卵巢切除后大鼠垂体前叶生长相关蛋白43免疫反应性及其与促性腺激素细胞的关系［J］. 神经科学杂志, 2003, 19 (6): 349-352.

    ［8］ Fredrick VG, Dragoslava Z, Stanko SS. Differential expression of ionic channels in rat anterior pituitary cells ［J］. Mol Endocrinol, 2001, 15: 1222-236.

    ［9］ Fredrick VG, Dragoslava Z, Antonio J, et al. Dependence of pituitary hormone secretion on the pattern of spontaneous voltagegated calcium influx ［J］. J Biol Chem, 2001, 276: 33840-3846.

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