短期学习记忆对小鼠脑组织内热休克蛋白表达的影响

【关键词】  热休克蛋白质70

    Expression of HSP in the mouse brain after shortterm learning and memory

　　【Abstract】 AIM: To investigate the association of heat shock proteins  (HSP70 and HSP27) with shortterm learning and memory. METHODS:  Thirty mice were randomly divided into 3  groups:  Trained group（TG）, swimming control group （SC） and blank control group（BC）. After shortterm  training, the mice were killed and the brains were prepared for tissue section. An immunohistochemical  method was used in detecting HSP70 and HSP27 expression. RESULTS:  A  significant increase in HSP70 levels was observed in hippocampus, cerebral cortex and nucleus amygdala in shortterm trained  group, a little expression in SC group and hardly no expression in BC group.  But no HSP27 expression was found in all the 3 groups. CONCLUSION:  HSP70 may be a critical molecule involved in shortterm learning and memory.

　　【Keywords】 learning; memory; Morris water maze; heatshock proteins 70; heatshock proteins 27;  immunohistochemistry

　　【摘要】  目的： 建立小鼠短期学习记忆模型，研究热休克蛋白70(HSP 70)、热休克蛋白27(HSP 27)是否参与学习记忆过程.  方法： 采用Morris水迷宫建立学习记忆模型，同时设立游水对照组及空白对照组. 训练结束后处死小鼠，取脑，灌注固定脑组织，冰冻切片，免疫组化染色检测脑组织中HSP70,HSP27的表达情况.  结果： 学习记忆模型组小鼠的海马、杏仁核簇及大脑额叶皮质高表达HSP70，游水对照组HSP70免疫阳性细胞数较少,空白对照组HSP70几乎无表达；HSP27在各组均无表达.  结论： HSP70可能是参与学习记忆的重要分子之一.

　　【关键词】 学习；记忆；Morris水迷宫；热休克蛋白质70；热休克蛋白质27；免疫组织化学

　　0引言

　　学习和记忆的机制至今不明. 热休克蛋白（heat shock protein, HSP）是一种在应激状态下产生的保护性蛋白质，具有复杂的生物学功能. HSP与学习记忆的关系如何，目前此方面的报道并不多见. 本文采用Morris水迷宫建立小鼠学习记忆模型，同时设立游水对照组和空白对照组，排除应激因素所引起的HSP表达，观察各组HSP表达的差异. 实验结果可望为研究学习记忆的分子机制提供新的思路.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　雄性昆明种小鼠30只，6周龄，第四军医大学实验动物中心提供. 利用随机数字表将其均分为3组，即正常空白对照组（BC）、游水对照组(SC)和学习记忆模型组(TG). 饲养条件为（22±1）℃，相对湿度40%~50%，昼夜非直接光照，自由饮食. 实验前动物适应环境15 d，以避免环境应激造成的HSP表达的变化.

　　1.2方法

　　1.2.1Morris水迷宫实验程序及组织准备Morris水迷宫（北京新天地科技公司）直径为90 cm，高度50 cm. 水深27 cm，平台置于水面下0.5～1 cm. 水温（21±1）℃. 采用视频图象处理系统记录小鼠寻找平台的时间及轨迹图. 参照Schimanski［1］的Morris水迷宫小鼠学习记忆模型建立方法，分为三个阶段训练小鼠. 训练前期：将小鼠放置于平台上，使其脱离平台后，在水中自由游泳30 s，然后引导其到平台上. 期间变换平台位置，共进行3次实验；训练期：将平台固定在一个象限的中点，每只动物从其它三个象限的任意位置头面向池壁释放入水. 记录动物游上平台的时间及轨迹图. 若60 s内小鼠未找到平台，人工将其引导至平台，并使其停留30 s，将游泳时间记录为60 s. 共进行4 d实验,8次/d，前4次实验为一组，后4次实验为一组. 组与组之间间隔时间约1 h，组内给予小鼠数分钟休息时间；空间探索期： 在训练期最后一次实验结束之后，撤除平台，让小鼠在池中游泳60 s，用于测试小鼠学会寻找平台后对站台的记忆能力. 学习记忆组完全按照上述方法行水迷宫实验,游水对照组与学习记忆组配对，水中不放置平台，使其游泳时间一致，也分4 d在同一时间进行. 空白对照组在实验期间一直置于正常饲养环境中. 实验在10：00～16：00进行，结束后将动物送回饲养室. 空间探索实验结束后24 h用10 g/L戊巴比妥钠麻醉小鼠，开胸，暴露心脏，先用生理盐水10 mL冲洗血液，然后用预冷的40 g/L的多聚甲醛(pH=7.4)固定液40 mL灌注固定完毕后取出全脑，后固定12 h，再将脑放入200 g/L的蔗糖溶液中,4℃过夜,组织块完全沉底后，用冰冻切片机连续冠状切片（冰冻切片机，Leica）,厚度14 μm.
 
　　1.2.2免疫组织化学检测采用生物素酶标链霉亲和素原理(即SP法)进行免疫组织化学检测（SP9003试剂盒，宝信公司）. 具体步骤如下，组织切片室温滴加30 mL/L的H2O2，以阻断内源性过氧化物酶活性，加入试剂A(封闭用正常兔血清工作液)，孵育13 min，分别加山羊HSP70, HSP27多克隆抗体（1∶100, Santa Cruze 公司 ，李新民教授惠赠）, 4℃过夜. 然后依次加入试剂B（生物素标记兔抗山羊IgG二抗工作液）、试剂C（辣根酶标记链酶素卵白素工作液），各置于室温中15 min，以上各步骤间PBS充分冲洗. DAB棕色法显色，脱水、透明、封片. 用无关抗体和PBS作替代或空白对照. 细胞质棕黄色为阳性信号. 每组随机取6张切片，每张切片取3个高倍视野（×40），进行阳性细胞计数.

　　统计学处理：  学习记忆组 Morris水迷宫实验结果采用逐步回归分析法，免疫阳性细胞计数结果用x±s表示，用t检验进行组间比较，SPSS11.0软件进行处理.

　　2结果

　　2.1学习记忆模型的建立采用逐步回归分析法，结果发现两个自变量(次数，天数)进入回归方程，回归方程为： Y=28.581-1.816X1-8.407X2,Y为时间（单位s），X1为次数，X2为天数. 即说明小鼠寻找平台潜伏期与训练天数、次数有线性回归关系. 随着训练天数次数的增加，小鼠寻找水下隐藏平台的能力得以提高. 空间探索实验阶段根据小鼠在各个象限的时间分布，发现小鼠在平台所处的象限游泳时间最长，而且实验中可看到小鼠放入池中最先在目标象限游泳. 对采集到的轨迹图进行分析，训练初期小鼠为边缘式搜索，但在学习记忆模型建成后，大多都为直线趋向式(Fig 1).

　　2.2脑组织中HSP70,HSP27的表达学习记忆模型组脑组织细胞质内有棕黄色沉淀物，在杏仁核簇、海马和大脑额叶皮质，阳性反应神经元密集分布（Fig 2）. 而游水对照组阳性细胞零星散布，空白对照组几乎没有阳性细胞表达（Fig 3）. 学习记忆组HSP70阳性细胞数(115.1±12.0)，明显高于游水对照组(22.7±8.1, P＜0.05）. HSP27在各组间未有差异，均未达到免疫组化检测水平.

　　3讨论
     
　　Morris水迷宫是研究啮齿类动物学习记忆的一种实验工具，简便易行. 强迫动物游泳及迷宫环境对于动物属于一种应激行为. 通过调节水温可把这种应激降低，但是实验动物的神经系统及内分泌系统仍会发生一些改变，可能影响空间学习记忆形成过程中细胞分子的表达. 神经递质受体和生长因子是参与学习记忆的主要细胞分子. 其中包括三种受体：亲离子受体、促代谢受体和跨膜受体. 而生长因子研究比较多的是脑源性生长因子，Yamada等［2］发现其对学习记忆有重要作用. 突触可塑性及神经元所形成的神经是学习记忆的神经生理基础. 对于长期学习记忆，突触结构需要转录翻译合成新的蛋白质. 而短期学习记忆，可以不需合成新的蛋白质，它的形成与突触局部变化有关，如酶的活化、蛋白质的磷酸化及相应的电生理的变化［3］. Lisman等［4］认为钙/钙调节蛋白引起激酶Ⅱ（ CaMKⅡ）活性的改变是短期学习记忆的典型代表，通过此途径使AMPM谷氨酸受体的活性增加，来调节突触功能. 突触蛋白Ⅰ,突触结合蛋白Ⅰ,突触融合蛋白等都是短期突触可塑性的调节信号. 本实验对小鼠短期学习记忆的分子机制进行了研究，发现HSP70高表达. 即Morris水迷宫短期学习记忆过程中有新的蛋白质合成.
      
　　目前，各个领域都对HSP进行了深入研究，分子伴侣是其最重要的生物学功能，此外还能装配、折叠新合成的蛋白多肽，降解变性、错误折叠的蛋白质，调控调节蛋白的活性，参与细胞器、分泌蛋白膜转位［5,6］.  研究［7］发现，预先给予热休克处理，可对东莨菪碱诱发的记忆缺损起一种保护作用，即热休克反应产物HSP70可保护胆碱能受体不与东莨菪碱结合，从而维持学习记忆相关细胞分子的正常功能. 本实验发现HSP70可孤立于应激因素，在短期学习记忆中表达. Morris水迷宫环境（即游水对照组）可引起HSP70的表达，但是这种与迷宫相关的应激并没有引起HSP70表达的显著变化，切片染色只有零星的免疫阳性HSP70细胞. 而学习记忆组可看到密集的HSP70免疫阳性细胞，这现象证明HSP70可能直接参与空间学习记忆的形成过程. 而HSP27在三个组均未有表达，说明HSP27与学习记忆无关. 新近研究［8］认为，HSP27主要为一种抑制子，对于防止细胞凋亡起重要作用.

　　最新观点［9］认为特殊的学习记忆行为由特殊的脑区来完成，如暗示性学习记忆相关脑区为新皮质、新纹状体、小脑或杏仁体，外在性学习记忆主要依赖于海马，工作性学习记忆建立在额前皮质与其他脑区相互作用相互联系的基础之上.  HSP在学习记忆信号通路中的详细作用机制还有待进一步研究. 我们可以从本实验中得到启发,对于临床上常见的轻度认知功能障碍、痴呆性疾病，尽早对其进行一些主动功能训练，可能可以通过增加HSP的表达来提高其学习记忆能力.

　　【】

　　［1］ Schimanski LA, Nguyen PV. Multidisciplinary approaches for investigating the mechanisms of hippocampusdependent memory: A focus on inbred mouse strains ［J］. Neurosci Biobehav Rev, 2004; 28(5):463-483.

　　［2］ Yamada K,  Mizuno M, Nabeshima  T.  Role for brainderived neurophic factor in learning and memory ［J］. Life    Sci, 2002; 70(7):735-744.

　　［3］ Zipursky A.  Learning,  memory and transcription  factors ［J］. Pediatric Res, 2003;53:396-374.

　　［4］ Lisman  J, Schulman H,  Cline H.  The  molecular basis of  CaMKⅡ function in synaptic and behavioural memory ［J］. Nat Rev Neurosci, 2002;3(3):175-190.

　　［5］ Bratincsak A, Palkovits M. Activation of brain areas in rat following warm and cold ambient exposure ［J］. Neuroscience, 2004;127(2):385-397.
  
　　［6］ Young JC,   Barral JM, Ulrich HF.  More than folding:Localized function of cytosolic chaperones ［J］. Trends Biochem Sci, 2003;28:541-547.

　　［7］ Hung  CH,  Lin  MT,  Liao JF, et al. Scopolamineinduced amnesia can be prevented by heat shock pretreatment in rats ［J］. Neurosci  Lett, 2004;364(2):63-66.

　　［8］ Concannon  CG,  Gorman  AM,  Samali  A.  On  the  role of HSP27  in  regulating  apoptosis ［J］. Apoptosis, 2003;8:61-70.

　　［9］ Morgado  I.  The psychobiology  of  learning  and  memory: Fundamentals and recent  advances ［J］. Rev  Neurol,  2005; 40(5):289-297.