一氧化氮在潘托拉唑对大鼠胃黏膜损伤保护中的作用
【关键词】 胃黏膜损伤
Role of nitric oxide in pantoprazoles protective effect from gastric mucosal lesion in rats
【Abstract】 AIM: To observe the role of nitric oxide（NO） in the protective effect of pantoprazole (PZ) on gastric mucosal lesion in rats. METHODS: Before gastric mucosal lesion was made in rats by pure alcohol, PZ（20 mg/kg）, NωnitroLarginine methyl ester（LNAME，4 mg/kg）, Larginine（250 mg/kg） and Darginine（250 mg/kg） were injected into the vein. Gastric mucosal blood flow（GMBF） was assessed with laser Doppler flowmetry（LDF）, gastric mucosal and serum NO-2/NO-3 were measured by cadmium granulation reduction and colorimetric method and the changes of ulcer index and the severity of tissue necrosis and neutrophils infiltration were observed. RESULTS: Ulcer index in the PZ group was much lower than that in the control group（P<0.01） and the degree of tissue necrosis and neutrophils infiltration were much milder than those in the control group（P<0.01）. The protective effect of PZ was significantly decreased by prior administration of LNAME. The inhibitory effect of LNAME was antagonized by prior administration of Larginine but not by Darginine. PZ administered into the vein obviously increased GMBF, gastric mucosal and serum NO-2/NO-3, which was prevented by pretreatment with LNAME but the antisecretory effect of PZ was not affected by LNAME. CONCLUSION: PZ has some NO mediated protective effect against gastric mucosal lesion in rats and the action of PZ against gastric acid secretion contributes little to the protective effect.
【Keywords】 nitric oxide；pantoprazole；gastric mucosal lesion；cytoprotection; rats
【摘要】 目的：探讨一氧化氮（NO）在潘托拉唑(pantoprazole, PZ)保护大鼠胃黏膜损伤中的作用. 方法：在乙醇诱导大鼠胃黏膜损伤前，预先给予PZ（20 mg/kg）,L硝基精氨酸甲酯（LNAME，4 mg/kg）,L精氨酸（250 mg/kg）及D精氨酸（250 mg/kg）静脉注射. 采用激光多普勒血流计（LDF）测定胃黏膜血流量（GMBF），采用镉粒还原和比色法测定胃黏膜和血浆NO-2/NO-3含量，并观察了胃黏膜损伤指数（UI）、溃疡坏死组织和中性粒细胞浸润严重程度的变化. 结果：与模型损伤组比，PZ组大鼠UI明显降低（P<0.01），溃疡坏死组织和中性粒细胞浸润程度明显减轻（P<0.01）. 预先用LNAME处理后，PZ保护胃黏膜损伤作用明显减弱；LNAME抑制作用可被L精氨酸拮抗，而不被D精氨酸拮抗. iv PZ，可增加GMBF、胃黏膜和血浆NO-2/NO-3，LNAME可逆转这种作用，但对PZ抑制酸分泌作用无明显影响. 结论：PZ对大鼠胃黏膜损伤保护作用与NO有关，这一作用与抑制胃酸分泌无关.
【关键词】 一氧化氮；潘托拉唑；胃黏膜损伤；细胞保护;大鼠
0引言
潘托拉唑（pantoprazole, PZ）是人工合成的新一代质子泵抑制剂（proton pump inhibitor，PPI）,对酸分泌有显著的抑制作用［1］；同时对胃黏膜具有保护作用［2-4］，但这方面作用机制尚未完全阐明. 一氧化氮（NO）是扩血管物质，可增加胃黏膜血流量(GMBF)，对胃黏膜具有保护作用. 我们研究NO在PZ对大鼠胃黏膜损伤保护中的作用，以探讨PZ对胃黏膜保护作用的可能机制.
1材料和方法
1.1材料
PZ(杨子江药业公司产品)，L硝基精氨酸甲酯（NωnitroLarginine methyl ester，LNAME）(Sigma公司产品)，L精氨酸、D精氨酸(上海华美工程公司). 镉粒(上海亭新工厂)，甘氨酸、亚硝酸盐(上海试剂一厂)，硫酸铜、N1奈乙胺盐酸盐(上海试剂三厂)，对氨基苯磺酸(上海山海科技研究所)，硫酸、硫酸锌、氢氧化钠、酚红(上海试剂二厂). 纯种、雄性、健康SD大鼠（上海西普尔必凯实验动物有限公司提供），体质量210~270 g，实验前禁食24 h，但不禁水. XHF1高速分解器(上海金山生化仪器厂)，TG328 B型分析天平(上海天平仪器厂)，801型离心机(上海手术器械厂)，724微机型可见分光光度计(上海光学仪器厂)，眼科手术器械一套. 激光多普勒血流计（LDF）(LDFⅢ型，南开大学制造)，技术参数如下：HeNe光源，功率2 mW，输出功率>1 mW，光纤长2.5 m，测定范围为1 mm半球区域，量程选×1档，时间常数1 s档，频率为4 kHz.
1.2方法
大鼠禁食24 h后，30 g/L戊巴比妥钠（4 mg/kg, ip)麻醉，用无水乙醇1 mL灌胃，1 h后腹正中切口进入腹腔，沿胃大弯处剪开胃，并进行各项实验指标测定. 取SD大鼠100只，分为6组，Ⅰ～Ⅳ组每组20只，Ⅴ，Ⅵ组每组10只. Ⅰ组：假手术组，作为正常对照；Ⅱ组：损伤模型组，作为损伤对照；Ⅲ组：PZ组，在用无水乙醇灌胃30 min前，iv PZ（20 mg/kg）; Ⅳ组：LNAME组，在iv PZ 20 min前，iv LNAME（4 mg/kg）；Ⅴ组：L精氨酸（Larginine）组，在iv LNAME 15 min前，iv L精氨酸（250 mg/kg）；Ⅵ组：D精氨酸（Darginine）组，在iv LNAME 15 min前，iv D精氨酸（250 mg/kg）. Ⅰ～Ⅳ组又各分成2小组，每小组10只，其中1小组用于胃酸、胃黏膜血流量(GMBF)、胃黏膜和血浆NO-2/NO-3测定，另1小组用于胃黏膜损伤指数(ulcer index, UI)判定和组织学观察. 对照组给予等量的生理盐水. 取胃液2 mL，加酚红指示剂2滴，黄色表示有胃酸存在. 用0.1 mol/L氢氧化钠滴定至粉红色. 所耗氢氧化钠mL数乖以50，即为胃酸浓度（mmol/L），并换算成pH.
1.2.1GMBF测定采用LDF测定GMBF，开机预热30 min调出LDFⅢ GMBF测定程序，从胃大弯处作一小切口，用LDF的探头轻轻垂直接触胃黏膜表面，待血流稳定后，在胃体大小弯、胃窦大小弯取4点测定GMBF，取其平均值，以激光多普勒信号电压值（mV）表示血流量的相对数值.
1.2.2NO-2/NO-3含量测定用钝性刀片刮取胃黏膜，组织匀浆离心后取上清液,-20℃贮存待测；取外周血2 mL，EDTA抗凝后取上清，-20℃贮存待测；NO-2/NO-3含量采用镉粒还原和比色法测定［5］.
1.2.3UI判定按Guth标准UI，处死动物，取出胃及十二肠，沿大弯侧剪开后，展平，按溃疡或糜烂面积大小给予计分：斑点状糜烂为1分;糜烂<1 mm为2分;糜烂介于1~2 mm之间为3分;糜烂为2~4 mm为4分;糜烂>4 mm为5分.
1.2.4组织学观察全胃用40 g/L甲醛固定，制成石蜡切片，HE染色光镜下观察，评定标准如下：①坏死物质：未见为0;仅在溃疡底面边缘有少许为（+）;薄层覆盖整个溃疡底为（）;厚层覆盖为（）. ②中性粒细胞浸润：未见为0;偶见（+）;明显（）;介于后两者之间为（）.
统计学处理：多组计量资料之间比较采用方差分析，组间两两比较用SNKq检验，方差不齐时采用KruskalWallis检验. 计数资料之间采用χ2检验.
2结果
2.1UI测定损伤模型组大鼠UI比正常对照组（0）明显升高（P<0.01）；PZ组与损伤模型组比明显降低（P<0.01）；LNAME组与损伤模型组比无明显差异，而比PZ组明显升高（P<0.01）；L精氨酸组与损伤模型组和LNAME组比均明显降低（P<0.01），D精氨酸组与损伤模型组和LNAME组比均无明显差异，而比PZ组明显升高（P<0.01，Tab 1）.表1大鼠胃黏膜损伤指数和组织学（略）
2.2胃组织学观察损伤模型组大鼠溃疡底部可见大量坏死物质，周围组织中中性粒细胞浸润明显；PZ组溃疡底部坏死物质和周围组织中中性粒细胞浸润均比损伤模型组明显减轻（P<0.01）；LNAME组溃疡底部坏死物质和周围组织中中性粒细胞浸润与损伤模型组比均无明显差异（P>0.05），而比PZ组严重（P<0.01）；L精氨酸组与损伤模型组和LNAME组比二者均明显减轻（P<0.01），与PZ组比无明显差异，D精氨酸组与损伤模型组和LNAME组比二者均无明显差异，而比PZ组严重（P<0.01，Tab 1）.
2.3GMBF损伤模型组大鼠GMBF与正常对照组比明显降低（P<0.01），PZ组与损伤模型组比明显升高（P<0.05），LNAME组与损伤模型组比无明显差异（P>0.05），而比PZ组明显降低（P<0.05，Tab 2）.表2大鼠GMBF，胃黏膜和血浆NO-2/NO-3 及胃液pH（略）
2.4NO-2/NO-3含量损伤模型组大鼠胃黏膜和血浆NO-2/NO-3比正常对照组均非常显著增加（P<0.01）；PZ组比正常对照组非常显著增加（P<0.01），亦比损伤模型组明显增加（P<0.05）；LNAME组与PZ组比显著减少（P<0.01），而与正常对照组比无明显差异（P>0.05，Tab 2）.
2.5胃液pH损伤模型组大鼠胃液pH与正常对照组比明显降低（P<0.05），PZ组与损伤模型组比明显升高（P<0.01），LNAME组与PZ组比无明显差异（P>0.05， Tab 2）.
3讨论
PZ是人工合成的PPI. 我们的实验结果显示，预先用PZ给由乙醇诱导胃黏膜损伤大鼠iv，与损伤模型组比，UI明显降低，病理组织观察，其溃疡坏死物质和周围中性粒细胞浸润亦明显减少，表明PZ对大鼠胃黏膜损伤具有保护作用. NO是由血管内皮细胞产生血管舒张因子，LNAME能明显降低大鼠GMBF和胃黏膜血红蛋含量，表明NO对胃黏膜损伤有保护作用. 我们用LNAME预先处理大鼠，能明显升高PZ降低的UI，溃疡底部坏死物质增多，周围中性粒细胞浸润也非常明显，在LNAME给药15 min前给予L精氨酸则能抑制这种损伤作用，而不被D精氨酸抑制，表明NO介导了PZ对胃黏膜的保护作用. 本实验结果显示，iv PZ，能明显增加胃黏膜和血浆NO-2/NO-3含量，同时GMBF亦升高，而在PZ iv 20 min前给予LNAME则能逆转这种作用. 本结果还显示，PZ能著显提高胃液pH，抑制胃酸分泌，而LNAME则对PZ抑制胃酸分泌的作用无明显影响.
【】
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