P2X嘌呤受体在初级伤害性感受中的作用

    【摘要】  P2X嘌呤受体(P2X受体)为配体门控阳离子通道，可表达于与伤害性信息传递有关的初级传入神经元的胞体、中枢端和外周端. 在外周P2X受体参与对伤害性和非伤害性刺激的反应；在脊髓背角，表达于突触前背根神经节神经元上的P2X受体激活后可易化谷氨酸的释放，参与脊髓背角的突触可塑性变化. P2X3亚单位只高度选择性表达于感觉神经元，应用P2X3受体反义寡核苷酸、基因敲除技术和选择性拮抗剂A317491的研究表明ATP和P2X3受体参与并调制伤害性信息的传递.
 
　　【关键词】  P2X受体；ATP；感受器，感觉；神经元，传入；脊髓

　　0引言

　　P2嘌呤受体是多种细胞共有的一类膜受体，能选择性地与胞外ATP结合，产生不同生物效应. 根据药特征被分为P2X及P2Y受体，采用分子生物学技术，已有七种P2X受体亚型（P2X17）及八种P2Y受体亚型被克隆（P2Y18）. 近来研究证实，伤害性感受器有丰富的P2X嘌呤受体的表达，特别是P2X3受体亚基的克隆，它只高度选择性表达于感觉神经元，因此P2X嘌呤受体在伤害性信息传递过程中的作用逐渐受到研究者的重视.

　　1P2X嘌呤受体的一般特性

　　P2X嘌呤受体（P2X受体）广泛分布于全身的各组织，包括神经元、神经胶质细胞、免疫细胞，以及心脏、血管、呼吸系统、胃肠道、泌尿生殖系统的平滑肌细胞. 对P2X受体亚基的分子结构进行分析，发现P2X受体只具有两个跨膜结构M1和M2，氨基端和羧基端均在细胞内. 功能性的P2X受体主要由同源二聚体构成. P2X受体与其他配体门控离子通道的激活一样，不需要经过膜和胞内信号转导过程，而是通过蛋白质构型的改变直接控制离子通道的状态，对小的阳离子如Ca2+, Na+, K+等为非选择性通道. 最近研究发现P2X受体与其他递质的受体离子通道相比有较高的Ca2+离子通透性［1］. 此外，P2X受体的功能还受许多因素调控，如胞外pH值、二价阳离子和单价离子的变化可调节P2X受体对ATP的结合（Li等，1997）.

　　2P2X嘌呤受体在初级传入神经的分布与功能

　　采用原位杂交技术证明，P2X16受体mRNA在背根神经节（DRG）、三叉神经节和结状神经节上均有转录，DRG和三叉神经节中P2X3受体mRNA的表达水平显著高于其他受体亚型（Collo等，1996）. 新生期大鼠用辣椒素处理后，其成年期DRG细胞P2X3受体转录水平显著下降，表明P2X3受体表达于与伤害性感受有关的小直径神经元中（Chen等，1995）. 免疫细胞化学研究发现，P2X16受体均可见于DRG神经元但以P2X3受体为主，在鼠的DRG和三叉神经节神经元中有近40%的细胞呈P2X3受体免疫阳性反应，主要为小到中等直径的神经元，这些受体高度表达在与凝集素IB4结合及对胶质细胞源性神经生长因子（GDNF）敏感的细胞上，很少见于对神经生长因子（NGF）敏感的降钙素基因相关肽（CGRP）能和P物质（SP）能细胞（Bradbury等，1998；Novakovic等，1999）. 尽管P2X2受体免疫阳性反应在DRG神经元也可观察到，但其表达水平显著低于P2X3受体，有些神经元可见P2X2和P2X3受体的共同表达.

　　电生理研究表明，ATP及其类似物αβmeATP可使40%~95%的大鼠离体DRG神经元引发内向电流（Burgard等，1999）. 这种反应主要表现为三种形式： ① 快速瞬间内向电流，此种电流失活快，持续时间小于100 ms. ② 慢失活电流，发生和失活均较慢，持续1~2 s.  ③ 瞬间和持续电流的复合型. 有研究发现，在表达P2X3亚单位的HEK293细胞，ATP引发的快速内向电流可被其拮抗剂阻断［2］，同时在P2X3受体基因敲除小鼠的DRG神经元也未观察到这种瞬间内向电流［3］，表明P2X受体引发的瞬间快失活电流是由P2X3受体的同源寡聚体亚单位形成的. 慢失活电流的反应形式与P2X2和P2X3亚单位在异源性系统中共表达相类似，可能是由P2X2/3的异源二聚体所介导，但是这种通道的精确亚单位组成尚不清楚.
 
　　P2X受体不仅在初级传入神经元的胞体有功能性表达，而且这些受体能双向转运至背根和外周神经. 在大鼠和小鼠光滑皮肤内的各类感觉神经纤维也可见P2X3受体免疫阳性反应（Vulchanova等，1998）. 在体和离体电生理研究表明P2X受体激动剂可选择性兴奋初级传入感受单位. 在人的皮内注射ATP后可见腓神经C类单位传入放电增加，这些感受单位多为热敏单位［4］. Dowd等在大鼠关节传入神经也发现，关节腔内给予ATP和αβmeATP后，50%的C多型伤害感受单位和65%的Aδ机械伤害感受单位传入放电显著增加，这种兴奋效应可被全身给予P2X受体拮抗剂PPADS抑制，用弗氏佐剂诱发慢性关节炎后，ATP及其类似物的效应未见显著变化（Dowd等，1998）. 但也有报道，慢性炎性痛模型形成后，ATP在DRG神经元激发的内向电流较对照组增加2~3倍［5］. 在离体大鼠隐神经标本上，ATP和αβmeATP主要兴奋C机械热伤害感受单位，低阈值的Aβ机械感受单位和Dhair感受单位对ATP和αβmeATP均不起反应，而在皮肤用角叉菜胶致炎后，伤害感受单位对ATP和αβmeATP的反应性均显著增强［6］，表明ATP可选择性兴奋初级传入伤害感受单位，可能为一种内源性致痛物质.

　　3P2X嘌呤受体在脊髓的分布与功能

　　在脊髓背角P2X2, 3, 4, 6受体mRNA均有表达. P2X4受体主要分布于脊髓背角内的胶质细胞［4］. P2X3受体阳性结构从DRG神经元轴突末梢进入背角的Ⅱ层深部，然而这种阳性反应在行背根横断术或选择损毁IB4阳性感觉神经后消失（Bradbury等，1998）［7,8］，可见P2X3受体主要分布于与脊髓背角神经元形成突触的DRG神经元中枢端.

　　Gu等在DRG和脊髓背角神经元共培养模型发现，表达于突触前DRG神经元上的P2X受体激活后可易化谷氨酸的释放（Gu等，1997）. Nakatsuka等［9］在脊髓薄片制备研究发现，突触前的P2X受体激活可使脊髓背角的自发性兴奋性突触后电流（EPSCs）增加，表明突触前的P2X受体调节从初级传入神经元到脊髓背角的感觉传递. 在脊髓背角的不同部位，P2X受体的调节作用表现为不同的模式. 在对伤害性和非伤害性刺激均产生反应的背角V层，激活突触前的P2X受体可诱发长时程的谷氨酸释放增加. 而在主要对伤害性刺激产生反应的背角Ⅱ层，激活P2X受体则产生瞬时的谷氨酸释放增加［10］. 类似研究也发现，在培养的感觉神经元上形成的突触中P2X受体调节的谷氨酸释放可根据培养状态的不同，表现为长时程或瞬时释放反应（Labrakakis等，2000）. 这些调制模式的不同可能是由于P2X受体亚单位在初级传入神经元中枢端的不同功能性表达形成的.
在脊髓背角Ⅱ层，P2X受体拮抗剂PPADS可改变脉冲激发的EPSCs比例（Li等，1998）. 在背角Ⅴ层，中枢端的P2X受体激活可使Aδ初级传入神经元形成的突触传递作用增强［9］. 这些结果与激活P2X受体引起中枢端谷氨酸的释放相一致，释放的谷氨酸可能进一步诱发脊髓背角NMDA受体介导的突触可塑性变化. 因此，P2X受体调节的突触传递增强可用来解释中枢敏化机制，即增强背角神经元对外周感觉传入的反应. P2X受体除增强初级传入神经元中枢端和背角神经元之间的兴奋性突触联系外，在GABA能神经末端的P2X受体激活后也可加强与背角神经元间的GABA能抑制性突触传递（Hugel等，2000）. 因此，ATP对感觉传递和背角神经元的兴奋性的调节将取决于ATP的作用部位和对兴奋性、抑制性突触之间作用的平衡.

　　初级传入神经元中枢端的P2X受体除了调节谷氨酸的释放外，可能还调节P物质和其他神经肽的释放. 免疫化学研究发现，有些表达P2X受体亚单位的感觉神经元同时可见SP, CGRP和生长抑素的表达（Petruska等，2000）. 培养的DRG神经元胞体和轴突在给予ATP后，可见SP以钙依赖方式排出，而且ATP的这种效应可被P2X受体拮抗剂PPADS和苏拉明所抑制，表明激活P2X受体可致DRG神经元SP的释放. 与此相一致的脊髓薄片研究也发现，ATP和αβmeATP可使脊髓背角神经元SP 受体（NK1）内化，也提示激活中枢端的P2X受体可致初级传入神经元中枢端的SP释放，因为只有释放SP才可使NK1内化［11］，说明内源性ATP可能调节神经肽能感觉信息传递.

　　4P2X嘌呤受体对伤害性感受的调制

　　大鼠爪部注射αβmeATP或ATP，可观察到剂量相关的急性伤害性感受反应.  用辣椒素预处理后，再注射αβmeATP不再出现伤害性感受反应，表明这种反应是由辣椒素敏感的伤害性感觉神经元参与形成的，这与免疫组织化学研究所表明的P2X3受体和辣椒素受体（VR1）在感觉神经元中共存的结果相一致（Guo等，1999）. 已有研究表明，在福尔马林实验中，脊髓鞘内给予P2X受体拮抗剂苏拉明、PPADS和TNPATP，能明显减轻福尔马林的自发痛行为（Tsuda等，1999）. 预先鞘内给予P2X受体选择性拮抗剂PPADS可剂量依赖性抑制大鼠足底皮下注射蜜蜂毒引起的持续伤害性感受，表明脊髓P2X受体参与蜜蜂毒诱发的持续痛行为（Zheng等，2000）. 但也有研究报道，鞘内给予苏拉明和PPADS不能减轻某些神经病理痛模型的触诱发痛（allodynia）（Liu等，2000；Stanfa等，2000），其原因可能为P2X受体在神经病理痛的诱发时发挥作用，而在维持神经病理痛时作用较小；也可能是部分参与神经病理痛的P2X受体亚单位对苏拉明和PPADS不敏感. 近来研究发现，在神经损伤引起的触诱发痛模型中，P2X4受体在损伤神经同侧的脊髓表达显著增加，脊髓鞘内给予P2X4受体反义寡核苷酸可降低神经损伤时P2X4受体的诱导且可抑制触诱发痛. 正常大鼠鞘内给予表达有P2X4受体的小胶质细胞，可产生触诱发痛，说明神经损伤的触诱发痛有小胶质细胞上的P2X4受体参与［12］.
 
　　近年来采用遗传学及开发特异拮抗剂等方法对P2X3受体亚单位在痛觉调制中的作用进行了深入研究. 大鼠脊髓鞘内给予P2X3受体反义寡核苷酸（ASOs），DRG神经元P2X3亚单位的表达水平显著降低. ASOs可显著减轻由弗氏佐剂（CFA）、福尔马林和 αβmeATP引起的伤害感受行为，而由角叉菜胶诱发的急性炎性痛模型中，ASOs不影响其伤害性行为［13］. 在神经结扎形成的神经病理痛模型中，给予ASOs 2 d内可显著降低触诱发痛，而在7 d后恢复到对照水平［14］. 由此可见，慢性炎性痛模型和神经病理痛大鼠鞘内给予ASOs后，均可抑制和逆转机械痛敏化的形成，而且痛敏化的减轻与P2X3受体的下调相一致，表明P2X3受体参与了慢性病理痛敏化的形成. 在P2X3基因敲除小鼠，其初级传入神经和DRG没有P2X3受体表达，福尔马林实验中可见自发痛行为降低，但Cockayne等［15］发现完全弗氏佐剂诱发的热痛敏却加强，同时膀胱充盈感觉受到影响［16］. 近来研究发现，P2X3同源二聚体和P2X2/3异聚体的高度选择性拮抗剂A317491可明显减轻由弗氏佐剂、福尔马林及结扎神经诱发的各种痛过敏反应. 在L5L6脊神经结扎形成的神经病理痛模型中，A31741的作用弱于坐骨神经慢性结扎模型［17］. P2X3亚单位在感觉神经元上的选择性表达，以及P2X3受体反义寡核苷酸、基因敲除技术和选择性拮抗剂A317491的应用，均表明ATP和P2X3受体在神经病理痛和慢性炎性痛的形成和维持中发挥重要作用.

　　P2X受体在一些典型痛模型中反应性增强的细胞机制尚不清楚，目前的研究主要有以下几方面. 在急性痛模型中炎性介质可加强ATP对C和Aδ类神经元上P2X受体的作用，如P物质和缓激肽可增强重组P2X3和P2X2/3受体引发的内向电流，P2X受体的这种增强作用为非竞争性的，可能是由于P物质或缓激肽受体激活后通过胞内转导，从而使P2X受体N端PKC位点的胞内磷酸化所致，最近又有研究表明炎性痛敏时P2X受体活性的增强，与初级感觉神经元的细胞外信号调节激酶（extracellular signalregulated protein kinase, ERK）信号转导通路的激活密切相关［18］. 此外，炎性介质可改变初级传入神经元的反应表型，如一些寂静伤害感受器的激活. 这种急性痛反应发生时间很短，不可能使受体由胞体合成后转运到中枢与外周端，因此这种短时程反应可能是由于受体的反应特性发生变化形成的，即已表达的受体恢复了对ATP的敏感，或胞体内的受体快速插入到胞膜表达［19］. 在慢性痛中P2X3受体激动剂的长时程反应，可能是由P2X3mRNA和受体蛋白的表达水平发生改变形成的［14］. 在坐骨神经横断和脊神经结扎后小直径DRG神经元上P2X3阳性反应显著降低（Bradbury等，1998），而在坐骨神经慢性结扎和三叉神经的分支齿下神经部分损伤模型中其阳性反应却增加，表明P2X3受体在损伤神经元表达下调而未受损神经元则上调（Novakovic等，1999）. 与此相一致的是Tsuzuki等［20］用原位杂交方法研究发现，横断某些神经的分支后，P2X3受体mRNA在损伤的DRG神经元显著降低而在邻近未受损神经元却表达增加. 然而P2X3受体的表达和神经元损伤程度之间的具体关系尚不清楚.

　　综上所述，P2X受体存在于不同类型的初级传入神经元和脊髓背角，在伤害性感受的外周以及中枢机制中发挥了不同的作用. 在外周P2X受体参与对伤害性和非伤害性刺激的反应，在脊髓水平，初级传入神经中枢端的P2X受体可以调节神经递质的释放和参与脊髓背角的突触可塑性变化. 在对伤害性感受的调制中P2X3亚单位也发挥了重要作用. 因此，深入研究P2X受体在初级伤害性信息传递过程中的作用机制，不仅有助于认识外周神经及初级感觉中枢对机体功能的调节作用，也能为临床疼痛提供新的思路.

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