pUDKH基因治疗犬下肢缺血后对血管、肌肉组织的影响

来源:岁月联盟 作者: 时间:2010-07-12

          作者:哈小琴,赵治华,吕同德,李元敏,任建平,吴祖泽  

【关键词】  pUDKH基因;血管;肌肉;组织病理

  【Abstract】 AIM: To observe the effects of pUDKH administration locally on blood vessels and muscles in dogs with hindlimb ischemia. METHODS: Dogs were anesthetized with an intravenous injection of sodium pentobarbital (30 mg/kg). Then the left external iliac artery as well as all of the above arteries were ligated completely with silk thread. Thus the completely ischemic hindlimb model was established. The dogs with completely ischemic hindlimb were randomly divided into 2 groups: control group (control vector pUDK) and HGF transferred group (pUDKH), 4-6 dogs each. Then pUDKH or pUDK was injected directly into the left ischemic limb muscles. Three months (90 d) after injection, left external iliac arteriography was performed, blood flow rate of the left femoral artery was quantified and the temperature of distal muscle in hindlimb was measured. At the same time,the left femoral artery and femoral around muscles at the sites of injection of pUDKH and pUDK plasmids were removed and stained with HE to observe their histopathological changes by light microscopic examination. RESULTS: The degree of augmentation of collateral vessel formation was significantly greater than that treated by control vector in hindlimb ischemia models. In addition, the blood flow rate of femoral artery in dogs treated with pUDKH was recovered on day 90, while the flow rate was only 1/5 to 1/3 in control dogs. Degeneration and breakage of muscle fibers and edema among muscle bundles were observed in ischemic limb of control dogs, but in ischemic hindlimb transfected with pUDKH, no significant pathological changes were found. For control dogs, collapse of the left femoral artery, thickening of vessel wall and stenosis even occlusion of small blood vessel among muscle bundles were observed, few new blood vessels were found. But in pUDKH dogs, above all were almost normal. CONCLUSION: pUDKH has a protective effect on blood vessels and muscles in dogs with hindlimb ischemia.

  【Keywords】 pUDKH;artery;muscle;histopathology

  【摘要】 目的: 观察pUDKH(携带肝细胞生长因子基因的质粒)基因犬下肢缺血后对其血管和肌肉组织病的影响. 方法: 杂种犬在静脉内注射苯巴比妥钠麻醉下,于左后侧腹股沟在股动脉由髂外动脉分支处的起始端进行全结扎,造成肢体缺血模型. 模型犬被随机分为对照组和pUDKH处理组,并在结扎后即刻分别注射pUDK(空白质粒)或pUDKH. 于手术后3 mo,行左髂外动脉造影术,测定股动脉血流量和下肢远端局部温度,并从被结扎的后肢股动脉及内外侧肌肉取组织标本,经常规组织病理切片染色,光学显微镜下观察. 结果: 3 mo时血管造影pUDKH组可见明显血管网的形成,而转移空质粒的对照组仅见少量新生血管;此时转移pUDKH组犬股动脉血流量已恢复到结扎前的水平,而对照组股动脉血流量仅为结扎前的1/5~1/3;转移pUDKH组结扎侧肌肉温度与健侧相比无明显差异,而对照组两肢体肌肉温度却相差1~2℃. 组织学观察对照犬可见结扎点远端股动脉塌陷,肌束间动脉管壁变厚,管腔变小甚至消失,少见新生的小血管;pUDKH处理组犬结扎点远端股动脉管腔开放,肌束间小动脉壁均普遍未见增厚,管腔亦未缩小;对照犬结扎侧肌纤维变性、断裂、肌束内水肿、脂肪性变,pUDKH处理组结扎侧的肌肉组织中上述病变不明显. 结论: pUDKH的局部注射对犬下肢缺血后血管和肌肉具有保护作用.

  【关键词】 pUDKH基因;血管;肌肉;组织病理

  0引言

  下肢缺血主要是血栓闭塞性脉管炎或糖尿病性下肢中小血管病变、周围神经病变等所造成的下肢慢性缺血,涉及血管、神经、肌肉等组织的病变,当病变进展而减少了动脉的横截面积至80%或更多时,患者表现间歇性跛行、功能障碍,甚至肢体坏死(坏疽). 目前对此尚无理想的药物治疗方法,最终需行截肢手术而致残,预后较差[1-4]. 近年来基因治疗为其开辟了一条新的途径,通过合适的载体介导,转移促血管生长因子的基因于缺血组织,可促进新血管在局部的产生,形成血管“网”和血管“桥”,建立“分子搭桥”机制.

  人肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)是一多功能生长因子,除促进血管新生外[4],对器官/组织的损伤有一定的修复作用[5],包括肌肉、神经等. 本文利用犬后肢结扎股动脉造成血管闭塞性疾病的动物模型,采用股动脉周围骨骼肌肉内多点注射携带HGF基因的裸质粒pUDKH方法,探讨其治疗犬肢体缺血时对其血管和肌肉组织病理学的影响,为局部pUDKH基因治疗的实际应用提供实验依据.

  1材料和方法

  1.1材料

  动物:河北地区草狗18只,雄性,年龄为1.5~3岁,体质量12~15 kg,由军事医学院动物实验中心提供. pUDKH: 携带人肝细胞生长因子基因的重组裸质粒, pUDK: 未携带人肝细胞生长因子基因的空质粒, 军事医学科学院放射医学研究所三室提供.

  1.2方法

  1.2.1动物模型的建立犬经15 g/L戊巴比妥钠静脉麻醉(30 mg/kg)后. 在无菌条件下分离左侧髂外动脉远端及分支和股动脉近端,将髂外动脉远端及股动脉分支全部结扎,造成左下肢血管完全闭塞性血管病模型. 在股动脉处安置血流量计探头,左外侧肌肉插入THRNST针型体温度电极,测定股动脉完全闭塞前、后10 min内股动脉血流量及左、右外侧肌肉温度,以判断左侧髂外动脉远端已完全闭塞. 右侧下肢动脉不予结扎.

  1.2.2基因转移将模型动物随机分为4组:模型对照组(给予不携带HGF基因的空质粒pUDK 0.30 mg/kg (6只),pUDKH 0.15 mg/kg组(4只),pUDKH 0.30 mg/kg组(4只)和pUDKH 0.60 mg/kg组(4只). 按每公斤体质量给犬的药量,将pUDK或pUDKH稀释在1 mL生理盐水中,于手术后10 min内,在左大腿肌内侧注射3点,左大腿肌外侧注射2点,每点注射体积为0.2 mL,最后逐层关闭伤口. 以后的饲养过程中不再进行基因转移.

  1.2.3动脉血管造影每组全部犬的术后90 d,于右侧股动脉内插管行至髂总动脉端,行左髂外动脉造影术,导管尾端连接一高压注射器快速注入泛影葡胺,拍摄X光片以观察新生血管和侧支循环的形成情况.

  1.2.4股动脉血流量及肢体温度测定在术前和术后0 d,90 d各测定股动脉血流量和下肢远端局部温度一次.

  1.2.5组织病检查于手术转基因后3 mo,从结扎的后肢股动脉及内与外侧肌肉取组织标本,经常规组织病理切片染色,光学显微镜下观察.

  统计学处理: 实验数据采用SPSS 10.0软件分析. 实验数据以x±s表示,用方差分析法及LSDt检验比较各给药组与对照组的差异,组内左、右比较采用配对t检验. P<0.05为有统计学意义.

  2结果

  2.1血管

  2.1.1转移质粒pUDKH可明显促进缺血肢体血管网的建立股动脉完全结扎后,转移质粒pUDKH组于结扎后即刻进行血管造影便可见到血流完全阻断,90 d时有明显的新生血管和血管网形成. 这些新生血管和血管网形成后,从股动脉结扎点到股动脉远端由许多小血管网连接,从而使髂外动脉灌注到结扎点远端股动脉血流运行通畅(图1A). 单纯转移空质粒
A: pUDKH组,转移pUDKH 0.30 mg/kg后第90日;B: 对照组,转移空质粒pUDK 0.30 mg/kg后第90日, 箭头所示为结扎部位.

  (pUDK)的对照组,90 d的新生血管数显著少于转移pUDKH基因组,股动脉结扎点以下的动脉全部消失(图1B). 转移pUDKH 0.15,0.30,0.60 mg/kg三个剂量组之间差别不明显,0.60 mg/kg组比其他2个给药组更容易使髂外动脉结扎点到股动脉接点缩短.

  转染pUDKH的三个剂量组在/100 cm2骨骼肌内、外侧和皮肤中血管数明显比模型对照组多,差别非常明显. 与未手术的右下肢骨骼肌内、外侧和皮肤比较,无明显的差异. 转pUDKH基因大、中、小剂量组犬骨骼肌组织之间的血管数与健康肢骨骼肌组织血管数相差不明显(表1).表1左下肢内、外侧骨骼肌和皮肤血管数的变化(略)

  2.1.2股动脉血流量及肢体温度测定髂外动脉完全结扎后即刻,股动脉血流量从平均(41.50±5.99) mL/min,下降为0,随着术后饲养时间的延长,模型对照组下肢股动脉血流有所增加,术后90 d比术后即刻增加了7 mL/min. 而转染pUDKH的3个剂量组在术后90 d,结扎侧股动脉流量已经恢复到术前的水平(表2).表2转染pUDKH后股动脉血流量(略)的变化

  转染pUDKH后90 d犬左侧下肢肌肉温度与健侧肌肉温度无明显差异,而模型对照组左右后肢肌肉温度相差1~2℃(表3).表3转染pUDKH后左侧肢体温度的变化(略)

  2.1.3股动脉形态对照犬有的股动脉仍处于塌陷状态,致使管腔几乎完全消失(图2A);pUDKH 处理犬股动脉的横截面上可见内弹力板完整,有的管腔已伸展完全,可与正常犬者相当(图2B).

  2.1.4肌束间血管形态对照犬肌束间小动脉管壁变厚、管腔变小甚至消失,且肌束间或肌外衣下纤维组织中也罕见新生的小血管. 中等大小动脉管腔亦变小、管壁变厚(图3A). pUDKH处理犬除个别者外,肌束间小动脉壁均普遍未见增厚,管腔亦未缩小. 此外,肌束间或肌外膜下的结缔组织中常含有较多的新鲜红细胞(图3B).

  2.2肌肉形态对照犬观察到结扎侧肌纤维变性、横纹不清晰;肌纤维及细胞核变细、断裂、染色淡,肌束内水肿,以及出现脂肪(图4A). pUDKH处理犬经各剂量处理的结扎侧的肌肉组织中上述病变均已不很明显(图4B).

  3讨论

  在实验中,经活体股动脉血管造影已清楚地观察到,pUDKH处理组犬使结扎侧肢体比用不携带HGFA: 对照组,转移空质粒pUDK后第90日,示肌束内及肌束间中小动脉管壁变厚,管腔变小,甚至几尽消失; B:pUDKH组,转移pUDKH(0.30 mg/kg)后第90日,示肌束间中小动脉管壁未见增厚,管壁无缩小,管腔内充满新鲜的红细胞.

  基因的空质粒处理的对照组犬的相应肢体中,更早而更多地出现新生的血管,转染pUDKH后90d血管造影可见到血管“桥”和“网”的大量的形成,髂外动脉完全结扎点血流仍然通畅,在结扎点周围有许多血管“网”和血管“桥”,使髂外动脉与股动脉血流通畅无阻,结扎点下方的股动脉血管变粗,血管充盈,使缺血损伤的股动脉的血管功能恢复,骨骼肌内、外侧有大量小血管形成,有助于股动脉远端的肌肉组织血液供应,从而使转染pUDKH动物肢体功能恢复,提高了动物的生存质量. 本文通过结扎后3 mo活杀时所取标本进行常规组织病理学观察的结果,也为此提供了组织形态学的证据. 转染pUDKH 0.15,0.30,0.60 mg/kg三个剂量组之间差别不明显,0.60 mg/kg组比其他2个给药组更容易使髂外动脉结扎点到股动脉接点缩短或完全融合成一个完整的血管网. 转染pUDKH的三个剂量组在/100 cm2骨骼肌内、外侧和皮肤中血管数明显比模型对照组多,差别非常明显. 与未手术的右下肢骨骼肌内、外侧和皮肤比较,无明显的差异. 转pUDKH基因大、中、小剂量组犬骨骼肌组织之间的血管数与健康肢骨骼肌组织血管数相差不明显,表明转染pUDKH的骨骼肌组织内血管并没有因药物剂量增加而血管成倍量的增长.

  由于被结扎的肢体于用HGF处理后得到了充分的血液供应,该患肢的肌肉也理所当然地获得了足够的氧气和必需的营养物质,从而促使其恢复因缺氧和营养物质而造成的结构与功能的损伤. 本文的组织病理学观察结果也为此提供了形态学的证据. 此外,结扎股动脉后只予以空白质粒处理犬的患肢肌肉中出现有肌纤维变细、断裂或某些肌束中有缺失肌组织以及脂肪组织浸润的现象,而在pUDKH处理组肌束中则少见这种图像;因此可以推测,随着血运逐渐重建的过程,已发生变性的肌肉就会发生逆转,而肌组织缺失处也会有新生的肌纤维予以补充. 这也是可能发生的,因已有报道表明HGF对能够形成新生肌纤维的肌卫星细胞有刺激增殖的作用[5].

  本文观察的结果(资料未列出)还表明,因股动脉被结扎而使血运严重受到干扰的患肢中从股神经直到肌束间的细小神经都发生了显著的退行变,累及轴突、髓鞘和施旺氏细胞核,而经pUDKH处理犬的各级神经均已得到了明显的恢复,有的甚至已经达到了正常犬的图像. 这些外周神经的恢复,估计得利于HGF的双重作用:①缺血造成的神经纤维损伤,由于HGF促进了供血系统的重建而得以修复;②据报道HGF本身也有促进神经恢复的作用[6]. 这两种因素在本实验模型中究系各起到多大比重,目前尚无法加以估计.

  本实验只是一个探索性的工作,因而没有在结扎并用空白的或携带HGF基因的裸露质粒处理后的不同时间段,进行系统性的动态取样观察. 推测在血管新生和形成血管网的早期节段,能够在剂量效应关系方面,或全或半结扎模型的疗效差别方面作出一定的评价. 如有可能今后可以做这方面的探讨,还要做一些特殊染色(例如肌肉和髓鞘等特殊染色方法)的观察. 除此之外,如有条件,还可做一些生理学指标的观察,例如在供血系统重建过程中对肌力和神经传导速度的动态观测量等.

  【文献】

  [1]Melillo G, Serino F, Cirielli C, et al. Gene therapy in peripheral artery disease[J]. Curr Drug Targets Cardiovasc Haematol Disord, 2004,4(3):295-300.

  [2]Kim HJ,Jang SY,Park JI,et al. Vascular endotherial growth factorinduced angiogenic gene therapy in patients with peripheral artery disease[J].Exp Mol Med,2004,36(4):336-344.

  [3]Isner JM, Walsh K,Symes J,et al. Clinical protocol: Arterial gene transfer for therapeutic angiogenesis in patients with peripheral artery disease[J]. Hum Gene Ther, 1996,7:959-988.

  [4]Ha XQ,Ren JP,Bi JJ,et al. Therapeutic angiogenesis induced by human hepatocyte growth factor gene in dog hindlimb ischemia models[J].Chin Sci Bulletin,  2003,48(7):676-680.

  [5]Miller KJ,Thaloor D,Matteson S, et al. Hepatocyte growth factor affects satellite cell activation and differentiation in regenerating skeletal muscle[J]. Am J Cell Physiol,2000,278(1):C174-181.

  [6]Kato N, Nemoto K, Nakanishi K,et al. Nonviral HVJ (hemagglutinating virus of Japan) liposomemediated retrograde gene transfer of human hepatocyte growth factor into rat nervous system promotes functional and histological recovery of the crushed nerve[J]. Neurosci Res, 2005, 52(4):299-310.