以STO细胞和hELF作为胚胎生殖细胞培养饲养层的比较
作者：刘永刚，李芳菲，陈地龙，王莎莉，王亚平
【关键词】 STO细胞；胚胎肺成纤维细胞；胚胎生殖细胞；人类
Comparison between STO cells and hELF used as feeder layers of embryonic germ cells
【Abstract】 AIM: To compare the influence on the growth of human embryonic germ (EG) cells by SIM mouse embryoderived thioguanine and ouabain resistant (STO) cells and human embryonic lung fibroblasts（hELF）respectively as feeder layers and the changes of the two kinds of the feeder layers themselves processed with mitomycin C. METHODS: We isolated and cultured hELF of 3-4 month embryos. The changes of the two kinds of the feeder layers themselves treated with mitomycin C were observed. STO and hELFs erved as feeder layer to cultivate human EG cells.The formation rate of embryonic germ cell colony and the expression of EG cell surface markers(SSEA1, SSEA4) expression were detected. to discuss the influence on human EG cell growth. RESULTS: HELF treated by mitomycin C survived longer than STO cells treated by mitomycin C did. There was no obvious difference between the two kinds of feeder layers in the formation rate and immunologic markers (SSEA1, SSEA4) of EG cell colony. CONCLUSION: HELF as feeder layers is better than STO cells in culturing EG cells.
【Keywords】 STO cells; embryonic lung fibroblasts; embryonic germ cells; humans
【摘要】 目的： 比较以STO细胞和人胚胎肺成纤维细胞(hELF)作为饲养层对人胚胎生殖嵴细胞(EG)生长的影响以及经丝裂酶素C处理后的两种饲养层的变化. 方法： 分离、培养3~4 mo hELF，观察经丝裂酶素C处理STO细胞和hELF后形态学变化，以STO细胞和hELF作为饲养层培养人EG细胞，计数EG细胞集落的形成率以及免疫组化检测EG细胞表面标志物抗阶段特异性胚胎抗原1(SSEA1)和抗阶段特异性胚胎抗原4(SSEA4). 结果： 经丝裂霉素C处理后hELF较STO细胞生存时间明显长，形态维持更好；以hELF和STO细胞作为饲养层培养人EG细胞，集落形成率没有明显差异；两种饲养层上形成的集落免疫学特征无明显差异. 结论： 在培养人EG细胞时，hELF饲养层较STO细胞饲养层更有优势.
【关键词】 STO细胞；胚胎肺成纤维细胞；胚胎生殖细胞；人类
0引言
自1998年Thomason等［1］首次建立人胚胎干细胞(embryonic stem cell, ES)系和Shamblott等［2］建立人胚胎生殖细胞(embryonic germ cell, EG)系以来，胚胎性干细胞研究已成为当今生命领域内的热门课题. 胚胎性干细胞作为组织工程的种子细胞，将为细胞、组织甚至器官替代提供无限细胞来源，也将为临床治疗模式带来革命性变革［3］. 谢松涛等［4］也对人胚胎生殖嵴来源的人EG细胞进行了培养，但迄今为止，来源于人胚胎生殖嵴的EG细胞系仅有一例报道. 有学者认为STO细胞在建立人EG细胞系过程中具有不可替代的作用. 由于STO 细胞是来源于鼠的成纤维细胞系，用STO细胞作为饲养层将会给临床应用带来潜在的危险. 我们用STO细胞和人胚胎肺成纤维细胞（human embryonic lung fibroblast, hELF）作为饲养层培养人EG细胞，旨在探讨两种饲养层经丝裂酶素C处理后的变化和对EG细胞生长的影响.
1材料和方法
1.1材料高糖DMEM培养基（Dulbeccos modified Eagles medium, DMEM）购自GIBICO公司； 无钙镁磷酸缓冲液 (Dulbeccos phosphate buffered saline, DPBS)、非必需氨基酸、二甲基亚砜、优质胎牛血清购自Hyclone公司；胰蛋白酶、β巯基乙醇、毛喉素（Forskolin）购自Sigma公司；丝裂霉素C 购自Kyowa Hakko Kogyo公司；胶原酶购自上海桥源生物制药公司； DNA酶Ⅰ购自Roche公司； 人重组碱性成纤维细胞生长因子 (human recombinant basic fibroblast growth factor, hrbFGF) 购自Pepro Tech EC公司；人重组白血病抑制因子(human recombinant leukemia inhibitory factor, hrLIF)购自CHEMICON公司；抗阶段特异性胚胎抗原1(SSEA1)mAb和抗阶段特异性胚胎抗原4(SSEA4)mAb由美国芝加哥大学Dr. Bruce Lahn提供；UltrasenstinveTM SP试剂盒购自迈新公司； DAB显色试剂盒购自中山公司；6～11 wk人工流产胚胎（重庆医科大学第二临床学院人流室同意提供）用于分离人EG细胞；3～4 mo胚胎用于制备hELF；STO细胞由本室保存.
1.2方法
1.2.1hELF分离、培养及铺板无菌条件下取3～4 mo人工流产胚胎肺组织，按照薛庆善等的方法分离获取hELF，常规方法培养传代，经反复传代获得纯化的hELF. 取对数生长期hELF，用终浓度为12.5 μg/mL丝裂霉素C处理2.5～3 h；DPBS洗3次； 2.5 g/L胰酶消化2 min；DPBS洗3次；以细胞浓度为2×105/mL种植在1 g/L明胶处理后的24孔培养板中，每孔1 mL；置37℃，95%湿度和50 mL/L CO2恒温细胞培养箱中培养，4 h后吸去培养液和尚未贴壁的细胞，换入等量培养液，置培养箱中备用，1 wk内均可使用.
1.2.2STO细胞铺板取对数生长期STO细胞，用终浓度为10 μg/mL丝裂霉素C按上述方法处理备用.
1.2.3人胚胎生殖嵴细胞的分离和培养无菌条件下取得的6～11 wk胚胎生殖嵴用DPBS冲洗3次；400 U/mL的胶原酶0.5 mL, 37℃下消化45 min；灭菌加样枪反复吹吸，将生殖嵴离散为小细胞团；1 g/L的胰蛋白酶和0.2 g/L EDTA溶液，37℃下消化5 min；加入等体积含100 mL/L胎牛血清的培养液终止反应；加入200 U的DnaseⅠ作用10 min；轻柔吹打使细胞分离，胚胎干细胞培养液重悬后以1×105, 1×10, 1×103/mL三种浓度种植于STO细胞和hELF细胞饲养层，胚胎干细胞培养液包含800 mL/L高糖DMEM, 200 mL/L胎牛血清,2 mmol/L L谷胺酰氨,0.1 mmol/L非必需氨基酸,0.1 mmol/L 2巯基乙醇,10 μmol/L Forskolin, 2 μg/mL hrbFGF, LIF 10×105 IU/L, 10×104 IU/L青霉素和10×104 IU/L链霉素. 置50 mL/L CO2, 95%湿度,37℃恒温细胞培养箱中培养，每天更换培养基.
1.2.4形态学观察用胚胎干细胞生长培养液培养经丝裂霉素C处理后的STO细胞饲养层和hELF饲养层14 d，在倒置相差显微镜下观察两种饲养层细胞的形态变化. 倒置相差显微镜下观察在STO细胞饲养层和hELF饲养层上人EG细胞集落形态.
1.2.5在STO细胞和hELF饲养层上EG细胞集落形成率用胚胎干细胞生长培养液将消化后的人胚胎生殖嵴细胞稀释成1×105, 1×104, 1×103/mL的细胞悬液，分别种植于STO细胞和hELF饲养层上，每种细胞浓度种植4个复孔. 置于37℃, 50 mL/L CO2饱和湿度恒温细胞培养箱中培养，每天更换培养基. 集落形成率，即4个复孔形成集落总数与种植细胞总数之比.
1.2.6免疫细胞化学检测取两种饲养层细胞上形成的集落，40 g/L多聚甲醛固定15~20 min；经PBS洗3次；按免疫组化SABC法检测细胞表面抗原SSEA1和SSEA4（一抗工作浓度为1∶50）. 设不加一抗组为阴性对照组.
统计学处理： 数据以x±s表示，采用SPSS12.0进行方差分析F检验. 显著性水平α=0.05, P<0.05为有显著性差异.
2结果
2.1hELF体外生长与传代原代培养时所得细胞，细胞形状多种多样. 传代细胞至第3～5代时细胞形态基本一致，以长梭形成纤维样细胞为主，细胞排列成为放射状、漩涡状或栅栏状（图 1A）. 将其反复传至第45代，在第5～30代时生长最旺盛，平均3~4 d达到汇合；第31～45代时平均5~6 d达到汇合，形态无显著变化.
2.2丝裂霉素C处理后STO细胞和hELF形态变化用人ES生长培养液培养STO细胞和hELF饲养层，培养48 h观察，STO细胞的培养液变黄，而人hELF的培养液颜色没有明显改变. 不更换培养液，培养72 h后，少部分STO细胞浮起，细胞内可见颗粒状物形成；培养超过6 d，大部分细胞浮起. 每3 d更换一次培养液，STO细胞培养5 d后有部分细胞浮起，细胞内出现颗粒状物（图 1B）. 而人hELF，培养7 d未见细胞浮起，细胞形态未见明显改变，并可维持14 d（图 1C）.
2.3两种饲养层细胞对胚胎生殖细胞集落形成的影响人胚胎生殖嵴细胞以1×105，1×104，1×103/mL三种浓度种植于STO细胞和hELF饲养层上，培养7 d后观察计数. 结果显示：以1×104/mL组，集落形成最多，集落形态典型 (图2A，B);1×103/mL组，集落形成数量最少；1×105/mL组，可见较多集落分化，集落细胞质中有颗粒样物出现,饲养层细胞和胚胎生殖细胞容易卷折. 以相同浓度种植胚胎生殖嵴细胞，两种饲养层细胞对人EG细胞集落形成率没有显著性差异.
A: 丝裂霉素C处理前hELF； B: 丝裂霉素C处理STO细胞后培养7 d；C: 丝裂霉素C处理hELF后培养7 d.
图1丝裂霉素C处理前后hELF和STO细胞×400（略）
A: hELF饲养层上EG细胞集落；B: STO细胞饲养层上EG细胞集落.
图2STO细胞和hELF饲养层上的EG细胞集落×400（略）
2.4人胚胎生殖细胞集落免疫学特征经检测集落表面抗原SSEA1和SSEA4，显示两种饲养层细胞上培养的人胚胎生殖细胞集落均表达SSEA1和SSEA4（图3A，B）.
A: hELF饲养层上表达SSEA1集落；B: STO细胞饲养层上表达SSEA4集落.
图3胚胎生殖细胞集落表达SSEA1和SSEA4×400（略）
3讨论
饲养层是建立和维持人胚胎性干细胞系未分化状态的必要条件. 迄今为止，己分离得到的非人灵长类和人胚胎性干细胞系无一不是在有饲养层条件下建立和维持的，在无饲养层的情况下，人ES, EG细胞毫无例外地分化为多种细胞类型. 目前已建立的人胚胎性干细胞系都以鼠源性胚胎成纤维细胞为饲养层［5］. 有报道称用人源性饲养层，如人胚胎皮肤和肌肉细胞、输卵管细胞和人骨髓基质细胞，也能维持人ES细胞体外增殖和保持其未分化状态，由于上述饲养层存在来源、体外增殖能力低等问题而在应用中受限［6-8］. 而在仅有的一例关于人EG细胞系的建系报道中，用MEF作为饲养层却是不成功的，因而有学者认为ST0细胞饲养层在人EG细胞建系中具有不可替代的作用. 这―结论是很难解释的，因为仅有一例报道，尚不能确定其他饲养层在人EG细胞建系中的确切作用，尤其是人胚胎成纤维细胞饲养层.
我们的研究结果显示： 1×104/mL接种的生殖嵴细胞在两种饲养层上形成的人EG集落最多，且经过对集落的表面标志物SSEA1和SSEA4的检测证实所形成的集落为人EG细胞集落. 但是以STO细胞作为饲养层和以hELF作为饲养层之间对EG集落形成率并无显著性差异. 提示两种饲养层都能较好支持人EG细胞的生长和克隆的形成. 以1×105/mL和1×103/mL接种的生殖嵴细胞形成的EG集落数量较少，而两种饲养层之间EG集落形成率没有显著性差异，提示以1×105/mL浓度种植的胚胎生殖嵴细胞浓度大，细胞生长过快，尤其是胚胎生殖嵴中的其它细胞生长快，容易和饲养层细胞一起卷折，不利于胚胎生殖细胞集落的形成. 还由于胚胎生殖细胞集落培养体系的营养供给不足，造成部分集落分化. 而种植浓度太低，也不利于集落的形成. 因此以1×104/mL作为最佳的种植浓度，且最有利集落的形成.
以STO细胞和hELF细胞作为饲养层分离、培养人EG细胞， hELF饲养层有以下优点： ① hELF与人EG细胞相同种属，不会引入异种蛋白和动物源性病原微生物，更有利今后临床应用；② 经过丝裂霉素C处理后，能在体外培养达14 d依然维持较好的生长状态. ③ hELF能体外连续传代50代以上，较鼠胚胎成纤维细胞、成人骨髓基质细胞等明显长，且经过多次传代后细胞均一，同质性高，有利于对其培养体系的精确分析. 不足的是， 迄今为止，没有利用hELF细胞饲养层建立人EG细胞系的报道.
【】
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