复方中药血清对四氯化碳刺激的肝星状细胞NO和ET

【关键词】  复方；肝星状细胞；一氧化氮；内皮缩血管肽1

　　Effect of drug serum of herbal compound on  NO and ET1 in cultured hepatic stellate cells stimulated by carbon tetrachloride

　　【Abstract】 AIM: To study the effect of drug serum of herbal compound on nitric oxide(NO) and endothelin 1 (ET1)in cultured hepatic stellate cells (HSC) stimulated by carbon tetrachloride (CCl4) and to explore the mechanism of herbal compound against hepatic fibrosis and portal hypertension. METHODS: ET1 and iNOS mRNA in HSC treated by drug serum of herbal compound and CCl4 were determined with reverse transcriptasepolymerase chain reaction (RTPCR) and ET1 and iNOS expressions were measured by immunocytochemical method. RESULTS: ET1 mRNA and protein expressions in HSC stimulated by CCl4 markedly increased(7.09±1.71 vs 42.44±2.58), and were notably higher than those in control group (0.56±0.28 vs 12.25±1.56, P<0.05); the expressions were inhibited by drug serum and the inhibitory effect was strengthened when combined with TGFβ1 antibody. Meanwhile, iNOS mRNA and protein expressions  slightly went up (0.96±0.16 vs 5.31±0.86) when compared with control group(0.63±0.19 vs 4.66±1.12), but the difference had no significance(P>0.05); the expressions in drug serum were higher than those in CCl4 group and control group and the expression of iNOS in CCl4+drug serum+TGFβ1 group was higher than that in other groups(P<0.05). CONCLUSION: Herbal compound decreased ET1 level and increased NO secretion in HSC stimulated by CCl4 to restrain HSC contraction.

　　【Keywords】compounds; hepatic stellate cells; nitric oxide; endothelin 1

　　【摘要】 目的： 研究复方中药对体外培养的大鼠肝星状细胞(HSC)一氧化氮(NO)和内皮素1(ET1)的影响，从细胞因子水平探讨复方中药抗纤维化和门脉高压的作用机理. 方法： 逆转录多聚酶链反应(RTPCR)法检测中药血清对四氯化碳(CCl4)刺激的HSC中ET1，iNOS mRNA的表达；SP法免疫细胞化学检测HSC ET1，iNOS的表达. 结果： CCl4刺激组HSC中ET1 mRNA表达及其含量(7.09±1.71 vs  42.44±2.58)明显增强，与空白对照组(0.56±0.28 vs  12.25±1.56)比较显著升高(P<0.05)，中药血清对其有显著抑制作用(P<0.05)，且联合应用TGFβ1抗体对CCl4刺激HSC ET1 mRNA的抑制作用加强；同时CCl4刺激组HSC中iNOS  mRNA和蛋白表达(0.96±0.16 vs    5.31±0.86)比空白对照组0.63±0.19 vs    4.66±1.12)轻度升高，但无显著差异. 药物血清处理组iNOS mRNA和蛋白的表达均高于CCl4和空白对照组(P<0.05)，且联合TGFβ1抗体作用HSC iNOS的表达高于其单独作用(P<0.05).  结论： 复方中药降低CCl4诱导的HSC ET1水平及增加HSC分泌NO途径而抑制HSC的收缩.
 　
　　【关键词】 复方；肝星状细胞；一氧化氮；内皮缩血管肽1

　　0引言

　　活化的肝星状细胞（hepatic stellate cell, HSC） 具有收缩及舒张功能，在调节肝窦阻力及微循环中具有重要作用，与肝硬化门脉高压症的发生及密切相关. 一氧化氮(NO)，内皮素1(ET1)是调节HSC收缩与舒张的重要因素［1-2］. 在肝纤维化形成的过程中，细胞因子起着十分重要的作用，其中转化生长因子β1 (TGFβ1)是最强烈的肝纤维化促进因子［3-4］. 我们采用TGFβ1抗体(Ab)阻断TGFβ1的作用，观察复方中药对体外培养的HSC NO和ET的变化，从细胞因子水平阐明复方中药抗纤维化的作用机制.

　　1材料和方法

　　1.1材料RPMI 1640培养基和RNA提取试剂盒(Gibco公司)；胎牛血清（杭州四季青生物制品公司）；胰蛋白酶(Sigma公司)；四氯化碳（CCl4）分析纯（天津泰兴试剂厂）；MMLV 逆转录酶，脱氧核苷三磷酸(dNTPs)，Oligo(dT) Primer， Taq DNA聚合酶（Promega公司）；兔抗TGFβ1多抗，兔抗iNOS多抗（Santa Cruz公司）；兔抗ET1多抗，SP免疫组化检测试剂盒（北京中山生物技术公司）；HH CPT型二氧化碳培养箱（上海福玛实验设备有限公司）；AmGene4800型PCR仪，凝胶成像系统（PE公司）；复方中药成分： 丹参30 g，当归15 g，莪术12 g，三棱12 g，鳖甲12 g，土鳖虫12 g，郁金15 g. 水煎醇提，最终使药液每毫升含生药2.5 g.  肝星状细胞株CFSC由美国Greenwel教授建株并惠赠，其表型为活化的HSCs,从CCl4诱发的肝硬化大鼠中分离并通过培养使细胞自发获得永生性［4］.

　　1.2方法

　　1.2.1药物血清制备取4只Wistar大鼠，体质量300～400 g, 药物剂量相当于65 kg成人每日用量的7倍，每日灌胃1次，3 d ，于末次给药后2 h再重复给药1次，第2次给药1 h，无菌条件下自下腔静脉取血，2000 r/min离心15 min，将相同条件下所采血清混含，56 ℃, 30 min灭活, 以除去可能存在的生物活性物质，再用0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌，密封后置于-20℃冰箱保存备用. 同时以生理盐水组制备的正常大鼠血清作对照. 将冷冻保存于液氮中的HSCs复苏后接种于含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液中，37℃, 50 mL/L CO2条件下培养. 当细胞呈单层致密状时,2.5 g/L胰蛋白酶消化后传代.
 
　　1.2.2实验分组实验均在呈指数生长的细胞中进行，细胞同步化于G0期后进行. 分为6组： ① 空白对照组；②  CCl4组；③ CCl4+大鼠血清组；④ CCl4+TGFβ1抗体组；⑤ CCl4+药物血清组；⑥ CCl4+TGFβ1抗体+药物血清组. 每组重复4个培养皿. CCl4浓度均为10 mmol/L, TGFβ1抗体为10 mg/L，血清(终浓度)为15 mL/L. 处理方法：首先加入CCl4，30 min后加入TGFβ1抗体或/和药物血清. 作用48 h后，收集细胞.
 
　　1.2.3HSCs ET1和iNOS mRNA表达的检测用Trizol试剂提取细胞总RNA，采用分光光度计测定提取的总RNA含量及纯度，A260 nm/A280 nm值在1.8～2.0之间. RTPCR引物由上海生工生物有限公司合成. 引物序列为： βactin引物,上游: 5′ACATCTGCT GGAAGGTGGAC3′,下游: 5′GGTACCACCATGTACCCAGG3′；ET1引物,上游: 5′CGTTGCTCCTGCTCCTCCTTGATGG3′,下游: 5′AAGATCCCAGCCAGAGCG3′；iNOS引物，上游:5′CGGTGCTGTATTTCCTTACGAGGCGAAGAAGG 3′,下游: 5′GGGGCGG CTTGTTA GGAG GTCAAGTAAAGGGC 3′，预计扩增长度分别为163 bp, 546 bp, 259 bp. 取总RNA 4 μg，按常规反应体系，于42℃反应1 h, 92℃加热5 min，灭活MMLV. 分别取逆转录产物cDNA 2 μL，50 μL   PCR反应体系中，10×PCR buffer 5 μL, 2 mmol/L dNTPs 2 μL，上下游引物各50 pmol，Taq DNA聚合酶3 U，进行PCR扩增，分别按以下参数进行30个循环.  ET1: 94℃预变性4 min, 94℃ 40 s, 55℃ 30 s, 72℃ 1 min, 72℃延伸7 min;  iNOS： 94℃预变性5 min, 94℃ 50 s, 60℃ 50 s, 72℃ 50 s, 72℃延伸10 min. 取扩增产物8 μL 在1.5 g/L琼脂糖凝胶上进行电泳，以凝胶成像系统对DNA扩增带进行图像分析，以每组细胞目的基因电泳带面积灰度值与βactin电泳带面积灰度值之比（iNOS/βactin, ET1/βactin）作为该目的基因表达的相对数值.

 
　　1.2.4HSCs ET1和iNOS表达的检测以5×108个/L接种12孔培养板(板内先放置盖玻片)中，每孔1 mL，作细胞爬片. 细胞行同步化处理后，按上述分组法加药继续培养48 h. 将培养板中的盖玻片取出，PBS缓冲液清洗细胞片3次，40 g/L多聚甲醛固定制作细胞片，按SP法试剂盒说明进行操作. 试验阳性结果为HSCs胞质或胞核内出现弥漫性黄色或黄褐色着色，并对染色后的细胞片进行显微镜下观察、摄片，图像分析软件分析每张切片于10×40放大倍数下，随机取上下左右中5个视野，自动检测免疫反应产物阳性信号光密度面积（占当时视野面积的百分比），取其均值. 实验重复3次.
 
　　统计学处理： 计量资料以x±s表示，使用SPSS 11.5统计软件包，多组间比较采用单因素方差分析(oneway ANOVA)，最小差值显著法(LSD)作组间统计学分析. P<0.05认为差异有统计学意义.

　　2结果

　　2.1HSCs ET1和iNOS mRNA的表达凝胶电泳可见，各处理组分别在546 bp，259 bp，163 bp处可见特异ET1，iNOS DNA，βactin条带 (图1). 凝胶成像系统定量分析结果显示，CCl4组HSC中ET1 mRNA表达明显增强，与空白对照组比较显著升高(P<0.05). TGFβ1抗体和/或药物血清组HSC ET1 mRNA的表达较CCl4组显著降低(P<0.05)，两者联合处理组ET1 mRNA低于单独TGFβ1抗体或药物血清处理组(P<0.05)；CCl4组HSC中iNOS mRNA的表达比空白对照组轻度升高但差异不显著(P>0.05). TGFβ1抗体和/或药物血清组iNOS mRNA的表达均高于CCl4和空白对照组(P<0.05)，且二者联合作用HSC iNOS mRNA的表达高于其单独作用(P<0.05)，正常大鼠血清组与CCl4刺激组ET1和iNOS mRNA表达均无显著差异（表1）.

　　M: marker;1: 空白对照组； 2: CCl4组；3: CCl4＋大鼠血清组；4: CCl4＋TGFβ1抗体组; 5: CCl4＋药物血清组;  6: CCl4＋TGFβ1抗体＋药物血清组.
 
　　图1肝星状细胞ET1和iNOS mRNA的表达（略）

　　表1中药血清对CCl4刺激的肝星状细胞ET1, iNOS mRNA和蛋白的影响（略）

　　aP>0.05 vs空白对照；CCl4 vs CCl4+大鼠血清.

　　2.2HSCs ET1和iNOS的表达免疫组化图像扫描分析表明，CCl4明显增加HSC ET1表达，中药血清和TGFβ1抗体对其有显著抑制作用(P<0.05)，且联合应用对CCl4刺激HSC表达ET1的抑制作用更强(P<0.05)；同时CCl4作用HSC后iNOS表达增加，但与空白对照组比较无差异，而中药血清和TGFβ1抗体明显增加iNOS表达，与CCl4组比较有显著性差异(P<0.05)，且联合应用iNOS表达高于二者单独作用(P<0.05)；CCl4+大鼠血清组与CCl4组ET1和iNOS表达均无显著差异（表1）.

　　3讨论

　　HSC在维持和调节门脉压中起中心环节作用，而影响HSC调节门脉压的重要血管活性物质是ET和NO. ET是目前已知的缩血管活性最强的多肽物质［5］，在门静脉高压症的形成过程中起重要作用［6］，激活的HSC是产生ET1的主要细胞，NO能阻断ET引起的HSC收缩，有明显的舒张HSC作用，NO部分抑制ET1的合成和释放，ET1则促进NO的合成和释放［7］. 我们观察结果显示，各组HSC均表达 ET1和iNOS mRNA，提示活化的HSC能分泌ET1和iNOS. CCl4所致的HSC中，ET1 mRNA和蛋白表达量显著升高，而iNOS mRNA和蛋白表达量与空白对照组比较无显著性差异. 中药血清和抗TGFβ1抗体均能显著降低CCl4诱导HSC ET1表达，并增加iNOS表达. 表明抗纤Ⅰ号复方中药和抗TGFβ1抗体可能通过降低CCl4诱导HSC ET1水平及增加HSC分泌NO途径，抑制HSC的收缩，从而降低肝窦阻力，降低门静脉压力，对于减轻和延缓肝纤维化门静脉高压的形成进程起重要作用.  复方中药血清和TGFβ1抗体联合作用优于二者单独作用，揭示复方中药血清不完全依靠抑制TGFβ1作用而影响HSC收缩.
 
　　TGFβ1在肝纤维化的形成过程中起着非常重要的作用，因此针对肝纤维化发生的关键细胞因子TGFβ1开发新的药物用以肝纤维化，仍是今后的研究方向之一.

　　【】

　　［1］ Bauer C, Kuntz W, Ohnsmann F, et al. The attenuation of hepatic microcirculatory alterations by exogenous substitution of nitric oxide by snitrosohuman albumin after hemorrhagic shock in the rat ［J］. Shock, 2004,21(2):165-169.

　　［2］ 冯雁康, 朱梁. 血管活性物质对肝星状细胞的影响及其治疗意义［J］. 国外医学消化系统分册，2003,23(4):225-227.

　　［3］   Tsukada S, Westwick JK, Ikejima K, et al. SMAD and p38 MAPK signaling pathways independently regulate alpha1(I) collagen gene expression in unstimulated and transforming growth factorbetastimulated hepatic stellate cells［J］. J Biol Chem, 2005,280(11):10055-10064.

　　［4］ Greenwel P, Schwartz M, Rossas M, et al. Characterization of fatstoring cell lines derived from normal and CCl4cirrhotic livers ［J］. Lab Invest, 1991,65(6):644-653.

　　［5］ Tsui JC, Dashwood MR. A role for endothelin1 in peripheral vascular disease ［J］. Curr Vasc Pharmacol, 2005,3(4): 325-332.

　　［6］ Luo B, Liu L, Tang L, et al. ET1 and TNFalpha in HPS: Analysis in prehepatic portal hypertension and biliary and nonbiliary cirrhosis in rats ［J］. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2004,286(2):G294-303.

　　［7］ Kelly LK, Wedgwood S, Steinhorn RH. Nitric oxide decreases endothelin1 secretion through the activation of soluble guanylate cyclase ［J］. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2004,286(5):984-991.