艰难梭菌毒素A羧基端基因的克隆与表达

来源:岁月联盟 作者: 时间:2010-07-12

              作者:杨晓强,王亚东,孙勇,陈学清,姜泊

【关键词】  艰难梭菌;毒素A;受体结合区;克隆,分子;基因表达

  Gene cloning and high expression of clostridium difficile toxin A Cterminal repeated unit

   【Abstract】 AIM:  To obtain the high expression of the gene coding for  clostridium difficile toxin A receptor binding zone  (CDTAR). METHODS: The clostridium difficile toxin A Cterminal repeated gene was amplified by PCR and cloned into the prokaryotic expression vector pET22b(+), and the recombined plasmid pETCDTAR was transformed into E.coli strain BL21(DE3). The recombined vector was confirmed by digestion with EcoRI/XhoI and sequencing. The E.coli strain BL21(DE3)  containing pETCDTAR was induced with IPTG and analyzed with SDSPAGE. RESULTS: A 35.7 ku protein was acquired after inducing with IPTG and thin layer scanning suggested that CDTAR occupied 36.1% of the total bacterial protein, 22.2% of the supernatant and 24.9% of the inclusion body. CONCLUSION: The cloning and high expression of clostridium difficile toxin A  receptor gene lay a  foundation for the further study on CDTAR function and clostridium difficile vaccine.
 
  【Keywords】 clostridium difficile; toxin A; receptor binding zone; cloning, molecular; gene expression

  【摘要】 目的: 克隆并表达艰难梭菌毒素A羧基末端受体结合区 (CDTAR)基因. 方法: PCR扩增CDTAR基因并将其克隆到表达载体pET22b(+),重组质粒转化到E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达, 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)对表达产物进行分析. 结果: 构建了含CDTAR基因的重组质粒pETCDTAR, IPTG诱导后SDSPAGE显示表达出Mr约为35.7 ku的重组蛋白,占菌体总蛋白的36.1%, 可溶性表达占上清的22.2%,包涵体中约占24.9%. 结论: 成功克隆了CDTAR基因,并构建表达了CDTAR重组蛋白,为进一步研究CDTAR功能及研制艰难梭菌疫苗奠定了基础.
 
  【关键词】  艰难梭菌;毒素A;受体结合区;克隆,分子;基因表达

  0引言

  艰难梭菌(clostridium difficile, CD)是一种G+厌氧芽孢杆菌,是内肠道感染的主要致病菌之一,临床上约50%的抗生素相关性腹泻和近100%的伪膜性肠炎与此菌有关[1-2]. 万古霉素及甲硝唑是该菌的主要药物. 但近年来国内外均已发现了多重耐药的菌株[3-4];疫苗研究已经成为防治CD相关性疾病的关键. CD产生的毒素A与毒素B是其主要致病因素,毒素B通常是在毒素A作用后引起肠壁细胞损伤,而艰难梭菌毒素A羧基末端受体结合区 (clostridium difficile toxin A receptor binding zone, CDTAR)则是毒素A与肠壁细胞结合的关键蛋白区域[5]. 研究表明,针对毒素A和B的抗体可以对CD的感染有保护作用. 因此,我们拟克隆CDTAR基因,并将其在原核菌中进行表达验证,为进一步研制CD疫苗奠定基础.

  1材料和方法

  1.1材料限制性内切酶,DNA marker DL2000,凝胶回收试验盒购自大连TaKaRa公司; Pfu DNA聚合酶购自美国Promega公司;T4 DNA连接酶购自美国Invitrogen公司; SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳低分子量标准蛋白质(蛋白质marker)购自上海西巴生物技术开发有限公司;其它试剂均为国产分析纯. 引物由上海生工生物有限公司合成;CD标准株VPI10463购自兰州生物制品研究所,并由南方医科大学南方医院消化病研究所实验室保存;质粒pET22b(+) 和受体大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)为南方医院消化病研究所CD疫苗研究课题小组保存.
 
  1.2方法

  1.2.1艰难梭菌毒素A受体结合区基因的扩增采用碱裂解法提取CD基因组DNA,以艰难梭菌基因组DNA为模板,设计并合成引物:在上游引物5′设计EcoRI位点,5′TCCGAATTCGGCCTCAACTGGTTATACAAGT3′,下游引物5′设计XhoI位点,5′GTGCTCGAGAGGGGCTTTTACTCCATCAAC3′,100 μL反应体系中加入10×PCR缓冲液10 μL, 25 mmol/L dNTPs  8 μL,上下游引物各1 μL,基因组DNA 1 μL, Pfu酶2.5 U,灭菌双蒸水补充至100 μL,反应条件: 94℃预变性5 min,然后进行如下循环,94℃变性45 s, 60℃退火45 s, 72℃延伸60 s, 35循环后72℃终延伸10 min, 10 g/L琼脂糖凝胶电泳观察扩增结果. PCR产物送上海博亚生物科技公司测序.
 
  1.2.2重组质粒pETCDTAR的构建与鉴定PCR产物及载体pET22b(+)经EcoRI与XhoI双酶切后,通过DNA凝胶回收试剂盒回收. 酶切纯化后的目的基因、质粒pET22b(+)按10:1(摩尔数)进行连接,反应体系为10 μL,室温下连接4 h,取100 μL CaCl2法制备的E.coli BL21(DE3)感受态细胞,加入5 μL连接产物,冰上放置30 min, 42℃热休克90 s,然后迅速置于冰上 2 min,加入500 μL SOC液体培养基,37℃摇床温和摇振(150 r/min)45 min以复苏细菌,吸取200 μL菌液,用铺菌器均匀涂布于含氨苄青霉素(终浓度100 μg/L)的 LB(LuriaBertani培养基,LB)平板上,37℃培养16 h. 分别挑取LB平板上生长的数个单菌落,加入含有氨苄青霉素(终浓度100 μg/L)的 5 mL液体LB  37℃ 200 r/min摇振12 h,提取质粒,并用EcoRI, XhoI进行双酶切鉴定,同时对重组质粒pETCDTAR用目的DNA引物进行PCR反应,重组质粒pETCDTAR送上海博亚生物科技公司进行测序.
 
  1.2.3目的基因的表达将含有重组表达质粒pETCDTAR 的E.coli BL21(DE3)10 mL培养过夜,以100 μL的过夜培养物接种10 mL LB液体培养基,在不同的诱导前菌液浓度(A600 nm分别为0.1, 0.3, 0.5, 0.6, 0.8, l.0)下,以不同的IPTG浓度(0.l, 0.4, 0.6, l.0, 2.0 mmol/L),诱导不同的时间(3, 4和5 h), 分别收集1 mL菌液,用于测定不同诱导条件下及不同部位重组蛋白的表达量.
 
  1.2.4表达产物的定位与分析① 外周质部分: 4℃, 12 000 g离心l min收集IPTG诱导培养物,将细菌沉淀悬于30 mmol/L盐酸羟基甲基氨基甲烷(TrisHCl, pH 8.0), 1 mmol/L 乙二胺四乙酸(EDTA, pH 8.0), 200 g/L蔗糖中,冰浴10 min, 12 000 g离心10 min,上清为外周质部分. ② 胞内可溶和包涵体部分: 同上收集1 mL IPTG诱导培养物,弃上清,重悬沉淀于1/10培养物体积的含50 mmol/L TrisHCl(pH 8.0), 2 mmol/L EDTA和0.l  mg/mL溶菌酶的缓冲液中,并加TritonX100至终浓度1%, 30℃放置20 min后冰浴下超声破碎至溶液较清亮,12 000 g,  4℃离心15 min,上清为可溶性部分,沉淀为包涵体. 包涵体经复性后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳. 表达产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳后,用薄层扫描仪分析表达产物占菌体总蛋白的相对含量.

  2结果

  2.1PCR扩增CDTAR基因从CD中提取基因组DNA,并以此为模板用高保真Pfu酶扩增出CD毒素A膜受体结合区基因,扩增的片段长度与预期相符,全长960 bp(图1).

  1: DL2000 DNA marker;2: PCR产物.

  图1琼脂糖电泳分析PCR产物(略)

  2.2重组质粒pETCDTAR的酶切鉴定与测序将PCR产物经EcoRI与XhoI双酶切后定向连接至经相同双酶切的pET22b(+)质粒中,得到的重组质粒命名为pETCDTAR. 将重组质粒用EcoRI与XhoI酶切后得到960 bp片段,与PCR产物大小相同,对重组质粒pETCDTAR进行测序,其序列与GenBank记录的CD VPI 10463毒素A羧基端序列完全一致(图2).

  M: DNA marker; 1: pET22b(+)/EcoRI; 2: 重组载体的EcoRI单酶切; 3: 重组载体的EcoRI及XhoI双酶切;4: 以重组载体为模板的PCR产物.

  图2重组质粒pETCDTAR酶切鉴定的琼脂糖电泳(略)

  2.3重组蛋白的诱导表达经IPTG诱导后,120 g/L  SDSPAGE分析表明,含有重组质粒pETCDTAR的宿主菌表达出Mr约为35.7 ku的重组蛋白,与理论上分析的分子量基本相符,而含质粒pET22b(+)及无质粒的细菌则无此特异条带. 在A600 nm为0.3~0.4时用IPTG(终浓度为1 mmol/L时)诱导5 h, CDTA蛋白表达水平最高,且以可溶性蛋白为主,凝胶薄层扫描分析表明重组CDTAR蛋白占细菌周质总蛋白36.1%,可溶性表达占上清的22.2%,包涵体中约占24.9%(图3).

  M: marker; 1: IPTG诱导5 h E.coli BL21 (pETCDTAR)总蛋白; 2: IPTG诱导4 h E.coli BL21 (pETCDTAR)总蛋白; 3: IPTG诱导5 h E.coli BL21 (pETCDTAR )总蛋白; 4: IPTG诱导5 h E.coli BL21 (pETCDTAR)细胞周质蛋白; 5: IPTG诱导5 h E.coli BL21 (pETCDTAR)包涵体蛋白; 6: IPTG诱导3 h E.coli BL21总蛋白; 7: IPTG诱导3 h E.coli BL21 (pET22b(+))总蛋白.

  图3表达产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析(略)

  3讨论

  目前已被用于人体试验的CD疫苗只有类毒素疫苗[6-7],即采用甲醛处理的CD毒素A和毒素B,经肌注途径进行接种. 对反复发作的CD相关性肠炎的临床试验表明,该疫苗可以CD引起的腹泻,还可以彻底根治单纯用药物治疗无效的多次重复发作的CD慢性感染. 表明CD的毒素作为抗原,可以很好地激发机体对于CD的反应,不仅可以有效预防CD的感染,对于CD的感染还有治疗作用. 该研究的结果也更进一步的提示,CD毒素是制备CD疫苗理想的抗原.  但接种时多采用侵入的方法如肌注等,不易被人们接受,副作用相对较多,制备时需纯化蛋白,过程复杂. 基因重组疫苗则通过基因工程技术表达CD毒素A和或毒素B羧基端重复单位. Zheng等[8]采用基因重组技术表达毒素A的EcoRI酶切基因片段 (5530~6577 bp)与毒素B的Apol酶基因片段(5464~6180 bp)连接形成1765 bp融合基因,此基因编码PCG4抗原表位,可以用于治疗CD引起的疾病. 在我们的研究中,仅选择了CD的A毒素羧基端序列,并通过网上数据库及生物信息学软件的分析,确定了A毒素的CDTAR编码区7319~8278 bp这段基因序列作为克隆表达对象,共960 bp,编码320个氨基酸.其编码的多肽中重复序列达12组,共27个多肽,具有良好的抗原性. 为CD毒素发挥毒性作用的重要组成部分.  通过PCR克隆和测序验证,表明我们成功地克隆了CDTAR基因.
 
  我们还对克隆的CDTAR基因,在大肠杆菌中进行了表达验证. 蛋白电泳的结果表明,我们所表达的蛋白,与该基因编码的蛋白的分子量大小是一致的,更进一步验证了我们克隆的CDTAR的在正确性. 该重组蛋白易于纯化,有利于CDTAR功能活性及其抗原性的研究. 因此,本研究为研制可运用人体的CD重组疫苗奠定了一定的基础.

  【】

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