褪黑素对乙醇致小鼠慢性肝损伤的保护作用

【关键词】  褪黑激素；乙醇；肝/损伤；慢性病

　　Hepatoprotective effect of melatonin on chronically ethanoltreated mice

　　【Abstract】 AIM: To investigate the changes of alanine aminotransferase(ALT), aspartate aminotransferase(AST), malondialdehyde (MDA) and pathological lesions of mice livers,which were caused by chronic alcohol drinking, and the protective effect of melatonin(MT) against ethanolinduced chronic  hepatotoxicity. METHODS: Fortyeight mice were randomly divided into 4 groups: control group(A), alcohol group (B), alcohol +high dosage MT group(C), and alcohol+low dosage MT group(D). 60  mL/L alcohol was used to induce hepatotoxicity in these mice. MT was injected at 20 and 5 mg/kg immediately after alcohol drinking  in group C and group D respectively.  The activities of ALT, AST and the levels of  MDA in liver homogenate were detected. And pathological lesion in liver tissue was evaluated. RESULTS: MT inhibited the increasing tread of MDA in liver homogenate and lowered the levels of ALT and AST in chronically ethanoltreated mice. MDA: the content in group D and C was lower than that of group B (P＜0.05);  ALT: the activity  in group D was lower than that of group B (P＜0.01), and  the activity  in group C was lower than that of group D (P＜0.01); AST: the activity  in group D was lower than that of group B (P＜0.01); the activity  in group C was lower than that of group D (P＜0.01). And in morphology MT could greatly prevent the lesions  of chronically ethanoltreated mice livers. Total pathological score: the score of group D was much lower than that of group B (P＜0.01); the score of group C was greatly lower than that of group D (P＜0.01).  CONCLUSION:  MT indeed hasa   protective effect on chronic ethanolinduced mice livers, which is positively associated with MT dosage.

　　【Keywords】  melatonin,  ethanol liver/injuries; chronic disease

　　【摘要】 目的： 探讨褪黑素(MT)对实验性慢性乙醇肝损伤小鼠脂质过氧化、肝功能和肝脏病理组织的影响. 方法： 将48只小鼠随机分为4组： 对照组（A组），模型组（B组），造模+高浓度MT给药组（C组），造模+低浓度MT给药组（D组）. 用60 mL/L乙醇制成小鼠慢性肝损伤模型，测定肝组织中丙二醛(MDA)含量、天冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)的活性，切片观察肝脏病理损害程度并评分. 结果： MT使慢性乙醇慢性肝损伤小鼠的MDA含量明显下降，有效降低AST和ALT活性，并与剂量呈正相关. MDA：造模+高浓度MT给药组和造模+低浓度MT给药组值均明显较模型组减低(P均＜0.05). ALT：造模+低浓度MT给药组活性值明显低于模型组(P＜0.01)；造模+高浓度MT给药组活性值明显较造模+低浓度MT给药组减低(P＜0.01). AST：造模+低浓度MT给药组活性值明显低于模型组(P＜0.01)；造模+高浓度MT给药组活性值明显较造模+低浓度MT给药组减低(P＜0.01). 病形态观察显示，MT能减轻肝脏病理损害程度，与剂量成正相关.  病理损害程度评分： 造模+低浓度MT给药组值明显低于模型组(P＜0.01)；造模+高浓度MT给药组值明显较造模+低浓度MT给药组低(P＜0.01). 结论： MT对慢性乙醇肝损伤具有一定的保护作用，且与药物剂量呈正相关.
 
　　【关键词】 褪黑激素；乙醇；肝/损伤；慢性病

　　0引言

　　嗜酒已经是日益影响人类健康的严重问题［1］，正确认识和防治乙醇性肝病极为重要. 虽然急性乙醇中毒已有显效药物［2］，但是乙醇所致慢性肝脏损伤的有效药物还很匮乏. 褪黑素(melatonin, MT）除了直接抗自由基［3］、抑制脂质过氧化反应外，还能增强体内抗氧化酶的活性，从而达到对自由基的杀灭能力［4］. MT在体内半衰期较短，主要代谢途径是经肝微粒体羟化酶催化生成6羟基褪黑素（6OH MT），6OH MT比MT有更强抗自由基作用［5］. 我们拟探讨MT对小鼠慢性乙醇肝损伤的保护作用，从而为乙醇致慢性肝脏损伤防治提供依据.

　　1材料和方法

　　1.1材料健康昆明小鼠8只，体质量18～22 g，雌雄各半(第四军医大学实验动物中心)；4 MT(1 g，纯度>99.5%，美国Sigma公司). 将MT溶解后加生理盐水稀释，配成浓度分别为10 g/L和2.5 g/L溶液，即配即用. 丙二醛(MDA)、天冬氨酸转氨酶(AST)和丙氨酸转氨酶(ALT)试剂盒(南京建成生物工程研究所)；二锅头白酒（北京二锅头酒厂）,产品标准号: Q大/EGT,6021996,一级,（乙醇浓度60度，V/V)；戊巴比妥，试剂为分析纯. DY89I型电动玻璃匀浆器（宁波新芝科器研究所）；MR1812离心机（美国Jouan公司）；紫外分光光度计（日本岛津，UV2100）；石蜡切片机；显微镜（日本Olympus公司BH2型）.
 
　　1.2方法

　　1.2.1动物分组将小鼠随机分为4组： 对照组（A组），模型组（B组），造模+高浓度MT给药组（C组），造模+低浓度MT给药组（D组），每组l2只.
 
　　1.2.2模型建立与给药A组生理盐水灌胃15 mL/(kg・d);B组乙醇灌胃15 mL/(kg・d) ，灌胃后1 h腹腔注射生理盐水2 mL/kg; C组乙醇灌胃15 mL/(kg・d) ，灌胃后1 h腹腔注射MT 20 mg/kg; D组乙醇灌胃15 mL/(kg・d) ，灌胃后1 h腹腔注射MT 5 mg/kg. 为造成慢性模型，乙醇最初稀释到浓度10度，以后每周提高10度，连续灌胃6 wk. 每日18:00点灌胃，19:00点腹腔注射MT，21:00点称体质量.

　　1.2.3指标测定

　　1.2.3.1丙二醛(MDA)测定实验进行6 wk后，禁食12 h称各小鼠体质量,将小鼠颈椎脱臼法处死,迅速取出全肝,用0.9 mL/L的冰冷生理盐水洗去残存血迹,用滤纸吸干,称肝质量后取肝左叶留作冰冻切片，另取肝右叶组织剪成约5 mm×5 mm的小块,放入DY89I型电动玻璃匀浆器匀浆,制成组织匀浆液［6］,硫代巴比妥酸比色法［7］测定A532 nm值. SPSS12.0统计软件将A值转换为含量值表示肝脏过氧化程度,值越高表示肝脏过氧化程度越高［8］.
 
　　1.2.3.2AST和ALT测定取上述组织匀浆液，硫代巴比妥酸比色法［7］测定A505 nm值. 通过对应标准曲线，应用SPSS统计软件找到A505 nm值对应的酶活力单位［7］，值越高说明肝脏损伤越严重.
 
　　1.2.4病理指标测定取肝脏左叶，冰冻切片，切片机作厚为5 μm的切片,HE染色，请校病理学教研室，由专业人员进行Olympus BH2显微镜下观察评分，从肝脏的一端视野开始记录细胞的病理变化，用40倍物镜连续记录70个视野(占整个的1/2). 观察指标为肝脂变、肝坏死、炎细胞浸润、纤维组织增生程度，4项之和为病理学总分. 其中，肝脂变、肝坏死、炎细胞浸润的评分为： 1分（微度），2分（轻度）,3分（中度）,4分（重度）. 肝脂变按照卫生部保健食品功效学评价标准评分. 微度： 肝细胞内含脂滴的肝细胞不超过1/4；轻度：含脂滴的肝细胞不超过1/2；中度： 含脂滴的肝细胞不超过3/4；重度： 肝组织几乎被脂滴代替. 肝坏死和炎细胞浸润参照肝脂变评价标准. 纤维组织增生程度： 1分（未见纤维组织增生）；2分（少量纤维组织增生局限门管区内）；3分（大量纤维组织增生向门管区外延伸）；4分（纤维组织互相连接,假小叶形成）. 以病理评分表示肝脏过氧化程度,分值越高表示肝脏病理损害程度越高.
 
　　统计学处理：  所有数据均以x±s表示，采用SPSS12.0统计软件，组间均数比较进行单因素方差分析，两组间比较采用LSDt检验，α=0.05.

　　2结果

　　2.1肝脏大体观察B组肝脏颜色较A, C, D组明显灰暗，体积大. B组平均肝脏质量为（2.0±0.2） g，A组 (1.7±0.4) g,二者差异显著（P＜0.01). C组 (1.8±0.4) g,与B组比差异明显(P＜0.05). D组的肝脏质量为(1.8±0.5） g,与C组比较无差异.
 
　　2.2MT对MDA含量的影响B组MDA含量明显高于A组（P＜0.01，表1）； C，D组分别与B组比较差异显著（P＜0.05，表1）.
 
　　2.3MT对AST和ALT活性的影响各组AST和ALT含量见表1. 各组之间两两比较均有显著差异（P＜0.01，表1）.