鼻NK/T细胞淋巴瘤中组织蛋白酶D和E
【关键词】 鼻肿瘤；淋巴瘤,T细胞；杀伤细胞,天然；免疫组织化学；原位杂交；组织蛋白酶D；E
Expressions and significances of cathepsin D and Eselectin in nasal NK/T cell lymphoma
【Abstract】 AIM: To explore the expressions and significances of cathepsin D (CD) and Eselectin in the newly recognized nasal NK/T cell lymphoma. METHODS: Immunohistochemical SP method was used in 41 cases of nasal nonHodgkin s lymphoma to examine the expressions of CD45RO, CD3ε, CD20, CD79α, CD56 and TIA1; In situ hybridization for EBER1/2 (EBERISH) was used to examine EpsteinBarr virus (EBV) infection. As a result, 21 cases of nasal NK/T cell lymphoma were diagnosed according to the newly published WHO standard. The expressions of CD and Eselectin were detected immunohistochemically in the 21 cases of nasal NK/T cell lymphoma and 10 cases of lymphoid hyperplasia. RESULTS: CD was expressed intensively in plasma of scattered stromal histiocytes and the positive signal of CD in nasal NK/T cell lymphoma was much stronger than that in lymphoid hyperplasia （t=39.12, P＝0.000）. The positive signal of Eselectin was expressed in vascular endothelium and the mean positive rates of the 2 groups had no significant difference statistically(t=0.688, P＝0.497). CONCLUSION: The higher expression of CD in the stroma of nasal NK/T cell lymphoma may relate to the high aggressiveness of nasal NK/T cell lymphoma, while Eselectin may have no intimate correlation with it.
【Keywords】 nasal neoplasms; lymphoma, T cell; killer cells, natural; immunohistochemistry; in situ hybridization; cathepsin D; Eselectin
【摘要】 目的： 探讨组织蛋白酶D（CD）和E选择素(Eselectin)在鼻NK/T细胞淋巴瘤中的表达及意义. 方法： 采用免疫组化SP法检测41例鼻部非霍奇金恶性淋巴瘤CD45RO, CD3ε, CD20, CD79α, CD56和TIA1的表达；EBER原位杂交法检测EB病毒感染情况，根据最新WHO分类及诊断标准诊断鼻NK/T细胞淋巴瘤；对完全符合诊断标准的21例鼻NK/T细胞淋巴瘤和10例鼻咽增生淋巴组织活检标本，用免疫组化方法检测CD和E选择素的表达. 结果： 鼻NK/T细胞淋巴瘤间质中组织细胞CD阳性信号的表达明显高于增生淋巴组织组(t=39.12, P＝0.000）；E选择素表达于血管内皮细胞，鼻NK/T细胞淋巴瘤与鼻咽增生淋巴组织中E选择素平均血管阳性率差异无统计学意义（t=0.688, P＝0.497）. 结论： 鼻NK/T细胞淋巴瘤间质中CD的表达明显增高，与该肿瘤高度侵袭性相关；E选择素与鼻NK/T细胞淋巴瘤恶性生物学行为无直接相关性.
【关键词】 鼻肿瘤；淋巴瘤，T细胞；杀伤细胞，天然；免疫组织化学；原位杂交；组织蛋白酶D；E选择素
0引言
新的研究表明，蛋白水解酶D（cathepsin D, CD）表达增高与许多恶性肿瘤的侵袭转移密切相关［1-3］， E选择素（Eselectin）作为介导肿瘤细胞与血管内皮细胞发生黏附的一种黏附分子，其受体和配体的相互作用在肿瘤转移过程中也发挥了一定作用［4-5］. 鼻NK/T细胞淋巴瘤是一种新的单独病变实体，也是鼻部区域最常见的恶性淋巴瘤，其临床具高度侵袭性，并有血管中心性破坏的特点. 我们应用免疫组化和原位杂交方法，根据最新WHO诊断标准严格诊断鼻NK/T细胞淋巴瘤，并对其进行CD和E选择素表达的研究，旨在探讨CD 和E选择素在鼻NK/T细胞淋巴瘤不良生物学行为中的作用.
1材料和方法
1.1材料41例鼻咽部非霍奇金恶性淋巴瘤和10例鼻咽部增生淋巴组织石蜡标本均取自第四军医大学西京病理科. 免疫组化选用的一抗有mAb CD45RO(Dako), CD20(Dako), CD79α(Neomarkers), CD56 (Neomarkers), TIA1(Counlter), Eselectin (Neomarkers)，多克隆抗体CD3ε(Neomarkers)和cathepsin D(Santa Cruz). 超敏SP试剂盒，购自福州迈新生物技术开发公司；液体DAB酶底物显色试剂盒，购自武汉博士德生物工程有限公司；PNARNA原位杂交检测EBV基因转录产物EBER1/2所用FITC标记的EBER1/2肽核酸探针（Y5200）和原位杂交检测试剂盒（Y5201），购自丹麦Dako公司；原位杂交专用盖玻片和二乙基焦碳酸盐（dethyl pyrocarbonate, DEPC），购自美国Sigma公司.
1.2方法
1.2.1肿瘤细胞表型检测对41例鼻部非何杰金氏恶性淋巴瘤采用免疫组化SP法检测T细胞抗原CD45RO和CD3ε；B细胞抗原CD20和CD79α；NK细胞相关抗原CD56和毒性颗粒相关蛋白TIA1. CD45RO, CD20, CD79α和CD56阳性定位于细胞膜，CD3ε和TIA1阳性定位于胞浆，>20%的肿瘤细胞着色判为阳性［6］.
1.2.2EBER原位杂交杂交所用器具均经1 mL/L DEPC水浸泡过夜并高压灭菌处理，载玻片常规清洁、硅化后，180℃烘烤4 h以去除RNA酶. 组织切片常规脱蜡，蛋白酶K消化，选用FITC标记的肽核酸（PNA）探针EBER在石蜡切片上作原位杂交，桥接碱性磷酸酶标记的抗FITC抗体，以NBT/BCIP为碱性磷酸酶的底物检测杂交信号，显色后，3 mmol/L核固红衬染. 20%以上细胞阳性着色诊断为ISH阳性. 用已知EBERISH阳性的淋巴结非霍奇金恶性淋巴瘤石蜡包埋组织作阳性对照，DEPC水代替含探针的杂交液作阴性对照.
1.2.3鼻NK/T 细胞淋巴瘤诊断标准［7］病理改变为瘤细胞血管中心性浸润并破坏血管. 瘤细胞具有NK细胞表型（CD56+）或毒性T细胞表型（CD3ε+）以及细胞毒表现型（TIA1+）并与EB病毒感染密切相关（EBER+）.
1.2.4鼻NK/T细胞淋巴瘤CD和E选择素的检测采用免疫组化SP法，用已知CD阳性和E选择素阳性的切片作阳性对照，用PBS代替一抗作阴性对照. CD阳性结果的定量采用格子系统（a grid system），格子为1 cm2，裱于10×目镜上并被分成4个小正方形. 在每例鼻NK/T细胞淋巴瘤及淋巴增生组织切片上分别随机记数10个高倍镜视野下固定方格内CD阳性细胞数，细胞计数最后被调整为个/cm2. E选择素阳性结果的定量按照每张切片随机观察并分别计数10个200倍视野中染色阳性的血管数和总血管数，平均阳性血管百分数/200倍视野.
统计学处理： 用统计软件SPSS10.0版对鼻NK/T 细胞淋巴瘤及增生淋巴组织CD和E选择素的表达进行Student s t检验, 以P<0.05为差异有统计学意义.
2结果
2.1鼻NK/T细胞淋巴瘤的诊断结果显示，41例非霍奇金恶性淋巴瘤中，T细胞抗原CD45RO阳性29例（70.7%），CD3ε阳性26例（63.4%），B细胞抗原CD20阳性5例（12.2%），CD79α阳性6例（14.6%），NK细胞相关抗原CD56阳性16例（39.0%），毒性颗粒相关蛋白TIA1阳性25例（60.9%），阳性信号位于胞质，呈颗粒状，阳性表达瘤细胞弥漫存在(图1A). EBERISH阳性30例（73.2%），阳性信号位于瘤细胞胞质内，多数肿瘤细胞质呈紫兰色阳性反应（图1B）. 结合免疫组化和EBERISH，确诊鼻NK/T细胞淋巴瘤21（男11，女10）例，年龄18～75（中位年龄48）岁，所有病例HE切片均有瘤细胞血管中心性浸润并破坏血管病理改变.
A： TIA1免疫组化DAB ×400；B： EBER原位杂交NBT/BCIP ×400.
图1鼻NK/T细胞淋巴瘤TIA1表达和EBER原位杂交（略）
2.2鼻NK/T细胞淋巴瘤CD的表达鼻咽增生淋巴组织标本中，平均每平方厘米有（26.3±3.8）个CD阳性细胞，阳性细胞多位于淋巴滤泡生发中心，滤泡外少而散在（图2A）. 鼻NK/T细胞淋巴瘤标本中，平均每平方厘米有（72.8±7.9）个CD阳性细胞，阳性信号位于间质内组织细胞胞质，阳性细胞多，阳性信号强，部分覆盖细胞核，瘤细胞不表达CD（图2B）. 经Students t检验，鼻NK/T细胞淋巴瘤CD阳性细胞数明显高于鼻咽增生淋巴组织（P<0.05）.
A： 鼻咽增生淋巴组织DAB ×100；B： 鼻NK/T细胞淋巴瘤DAB ×400.
图2鼻咽组织CD的表达（略）
2.3鼻NK/T细胞淋巴瘤E选择素的表达10例鼻咽增生淋巴组织和21例鼻NK/T细胞淋巴瘤中，E选择素的表达均表现为间质血管内皮着色（图3A, B）. 前者每200倍视野平均阳性血管百分数为（60.1±6.7）%，后者为（61.9±6.8）%，二者差异无统计学意义（P>0.05）.
A： 鼻咽增生淋巴组织；B： 鼻NK/T细胞淋巴瘤.
图3鼻咽组织E选择素的表达DAB ×400（略）
3讨论
鼻NK/T细胞淋巴瘤好发于鼻咽部，又名中线恶性网状细胞增生症，致死性中线肉芽肿，恶性肉芽肿，坏死性肉芽肿，中线外周T细胞淋巴瘤等. 长期以来，缺乏对该疾病一致的认识和统一的命名，因而，对其临床高度侵袭性和血管中心性破坏现象机理的研究也很少. 在2001年新的WHO淋巴造血系统肿瘤分类中，该疾病作为一种新的单独病变实体被提出，并命名为鼻NK/T细胞淋巴瘤.
CD是一种溶酶体酸性蛋白酶，在肿瘤组织中，活化的CD 能催化降解基底膜和细胞外基质，促进肿瘤的浸润和转移. 以往的研究表明，CD可以表达于肿瘤细胞，也可以表达于间质细胞［1-3］，但是，肿瘤间质CD的表达比肿瘤细胞中的表达更有价值［8］. 我们的研究表明，鼻NK/T细胞淋巴瘤中，CD阳性信号仅出现于间质组织细胞，且肿瘤组中CD表达明显高于对照组. 我们认为，间质内组织细胞CD表达增高，使得大量的CD进入间质，造成细胞外基质降解，局部溶解，有利于肿瘤细胞的侵袭. 鼻NK/T细胞淋巴瘤临床表现侵袭性强，常表现为鼻腔溃疡，中线面部破坏，以往的研究认为毒性颗粒相关蛋白和穿孔素与鼻NK/T细胞淋巴瘤高度侵袭性相关［9-10］，我们的研究表明CD在鼻NK/T细胞淋巴瘤间质中的表达与该肿瘤高度侵袭性也密切相关.
E选择素是由唾液酸化路易斯a或x抗原(Sialyl Lewis a或x antigen, slea或slex)介导的内皮细胞与癌细胞结合的黏附因子，血管内皮细胞表达的E选择素与其配体slea或slex专一性结合，在血管浸润、肿瘤转移中起重要作用［4］. 鼻NK/T细胞淋巴瘤病理改变表现为多形性瘤细胞呈血管中心性生长，浸润并破坏血管，提示E选择素可能在其中发挥作用. 而我们的研究结果显示鼻NK/T细胞淋巴瘤和鼻咽增生淋巴组织E选择素的表达差异无统计学意义，表明E选择素的表达与该肿瘤的高度侵袭性无直接关系. 我们认为，尽管E选择素在血管浸润、肿瘤转移中起重要作用，但细胞间的黏附是一个复杂的过程，E选择素只是其中一个环节，其配体slea或slex的活性也是很必要的，所以E选择素并不是侵袭及转移唯一的或独立的因素. E选择素如何与其他因素协同引起肿瘤的侵袭与转移尚需进一步探讨.
【】
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