大鼠帕金森病模型99mTc
作者：杜明华，贾鹏，王夕海，刘思明，居胜红
【关键词】 帕金森病；多巴胺转运蛋白；99mTc
Distribution of 99mTcTRODAT1 in brain of rats with Parkinsons disease
【Abstract】 AIM: To develop 99mTc labeled dopamine transporter (DAT) imaging agent 99mTc(2β ［N, N, bis(2mercaptoethyl)ethylenediamino］methyl, 3β(4chlorophenyl)tropane (TRODAT1) for evaluating the changes of DAT in rat models with Parkinsons Disease(PD). METHODS: A total of 40 SD rats were randomly divided into 3 groups: control group (n=14), unilateral PD models (n=14) and multiple cerebral infarction models by injecting autothrombus into carotid artery (n=12). 99mTcTRODAT1 distribution in normal rat striatum was observed. The uptake rates of 99mTcTRODAT1 in healthy side and injured side of PD rat striatum and in two sides of multiple infarction rat striatum were compared. RESULTS: 99mTcTRODAT1 distribution in normal rat brain and striatum exhibited an obvious uptake of 99mTcTRODAT1 in striatum. In PD rats, the uptake was less in injured striatum than that in normal striatum obviously. The uptake rate of multiple infarction rat was similar with that of normal rats. CONCLUSION: 99mTcTRODAT1 might be uptaken specificly by rat striatum, so its imaging can provide a beneficial evidence for the early diagnosis of PD.
【Keywords】 Parkinson disease; Dopamine transporter; 99mTcTRODAT1
【摘要】 目的： 研究多巴胺转运蛋白（DAT）显像剂99mTc2β［N，N’双（2巯乙基）乙撑二胺基］甲基，3β（4氯苯基）托烷（99mTcTRODAT1）用于评价帕金森病(PD)大鼠模型早期改变的价值. 方法： 将SD大鼠分为3组： ① 对照组(n=14)只；② 单侧PD模型组(n=14)（颅内单侧纹状体毁损）；③ 多发性腔梗模型组(n=12)（颈动脉注射自体血栓术）. 观察正常对照大鼠脑内、纹状体内99mTcTRODAT1分布情况，比较单侧PD模型组健侧与毁损侧及多发性腔梗模型组双侧纹状体99mTcTRODAT1的摄取比值. 结果： 对照组大鼠脑内和纹状体内分布实验表明，纹状体明显摄取99mTcTRODAT1；单侧PD模型组大鼠分布实验表明，毁损侧纹状体99mTcTRODAT1摄取较健侧明显减少；多发性腔梗模型组大鼠的结果与对照组相似. 结论： 99mTcTRODAT1显像剂被纹状体特异性摄取，为PD病早期诊断提供了有力依据.
【关键词】 帕金森病；多巴胺转运蛋白；99mTcTRODAT1
0引言
帕金森病（parkinsons disease, PD）的神经病特征是纹状体内多巴胺（dopamine, DA），尤其是壳核内多巴胺转运蛋白（dopamine transport protein, DAT）的丧失，继而出现帕金森症状. 早期诊断无客观指标，临床诊断率不高. 我们建立SD大鼠PD模型，利用多巴胺转运显像剂99mTc2β［N，N双(2巯乙基)乙撑二胺基］甲基,3β（4氯苯基）托烷（99mTcTRODAT1）的脑内分布，探讨99mTcTRODAT1在评价PD模型中的早期诊断的价值.
1材料和方法
1.1材料① 动物： SD大鼠40只，雌雄各半，体质量230～250 g，购自江苏省南京市浦口实验中心. 饲养温度18～25℃,湿度60%~70%，采光，普通饲料喂养，自由饮水进食. 将大鼠随机分3组： 对照组(n=14只)，单侧PD模型组（n=14只），多发性腔梗模型组（n=12只）. ② 试剂： 阿朴吗啡(美国Sigma公司)；戊巴比妥钠(上海精细化工厂)；99mTcO4新鲜淋洗液(南京森科核药房)，TRODAT1（江苏省原子医学研究所）. ③ 仪器： 三维立体定向仪(SN2型)，微量推进器(MO01SWCJIF）均为日本 NRISHIGE公司产品；透射电镜(日本Olympus 型号CX31)；γ免疫测量仪(上海辐日公司SN682型).
1.2方法
1.2.1PD模型鼠的制作利用6OHDA脑立体定位注射制作大鼠PD模型［1］. 100 g/L戊巴比妥腹腔注射麻醉大鼠后，将大鼠固定在脑立体定位仪上，门齿沟平面比耳间线平面低2.4 mm，剪去头毛，切皮暴露颅骨前囟点，参照大鼠脑图谱，将3 g/L 6OHDA 注入单侧纹状体；分两点注射，每点缓慢注射20 μg（溶解于含1 g/L抗坏血酸的生理盐水中，共4 μL）. 注射速度1 μL/min，注射至2 μL后将微量进样器提起2 mm，注射剩余的2 μL后留针10 min. 阿朴吗啡诱导旋转实验：毁损手术后1，3，5，7，14和21 d， 腹腔注射1 mL盐酸阿扑吗啡(apomorphine, APO)(0.5 mg/kg)，5 min后用旋转检测仪记录动物40 min内的旋转情况（旋转次数以大鼠向对侧不改变方向旋转360°为一次标准），每次旋转次数达7圈以上为成功的PD模型鼠.
1.2.2多发性腔梗模型的制作双侧颈总动脉连续注入自体血栓术：100 g/L戊巴比妥腹腔注射麻醉大鼠后，取颈正中切口，分离结扎右侧颈外动脉、右颈总动脉，分离右颈内动脉，小心从切口处快速连续注入自体血栓. 成模标准为大鼠行动迟缓，呆滞，出现逆时针绕圈（追尾现象），旋转次数少于6次/min.
1.2.399mTc TRODAT1在PD模型鼠脑内分布实验毁损术后14 d，分别给三组SD大鼠尾静脉注入99mTcTRODAT1 37 MBq(2 mL)，分别于0.5，1，2和4 h后随机断颈处死各3只，取出三组大鼠两侧纹状体及小脑（其中单侧PD模型组键侧、毁损侧纹状体分开测定），分别称质量，利用自动γ计数器测放射性计数，计算纹状体与小脑摄取比值（ST/CB）.
1.2.4PD动物模型的透射电镜检测毁损术后7 d，随机取对照组大鼠（2只）和单侧PD模型大鼠（2只），行为学测试完毕后，腹腔注射100 g/L戊巴比妥麻醉大鼠，用9 g/L NaCl 100 mL经心脏冲洗血液，40 g/L多聚甲醛300 mL灌注固定脑组织，断头取脑后继续固定24 h，取双侧纹状体25 g/L戊二醛250 mL固定，常规电镜超薄切片，醛酸双氧铀2 g加500 mL/L乙醇100 mL，静置10 min，染色，电镜观察.
统计学处理： 全部数据用x±s表示，应用SPSS10.0软件分析，组间比较采用Kraskalwallis秩和检验，两两比较采用Nemenyi法. 双侧纹状体比值的比较采用t检验分析. 以α=0.05为检验水准.
2结果
2.1标记率及放化纯度99mTcTRODAT1在层析过程中的迁移指数（Rf）为0.9～1.0， 99mTcGH, 99mTcO4-和99mTcO2 Rf值为0.0～0.1，放化纯度为92.6%，室温放置6 h稳定.
2.2PD模型鼠的行为学PD模型组7 d开始出现旋转，旋转圈数和转速逐渐增加，启动时间逐渐延长（表1），并没有自发恢复倾向. 由于采用了两点注射法，处理的27只大鼠中，有14只制成模型，成模率高达57%.
表1PD模型大鼠阿朴吗啡诱导旋转实验数据（略）
2.3多发性腔梗模型行为学大鼠左侧肢体行动迟缓、呆滞，出现逆时针绕圈（追尾现象），旋转次数(旋转次数以大鼠向对侧不改变方向旋转360°为1次标准)少于6次/min. 共成模12只.
2.4透射电镜图像毁损术后7 d，对照组、单侧PD模型组大鼠健侧纹状体均见清晰正常的多巴胺神经元细胞，单侧PD模型组毁损侧可见毁损的多巴胺神经元细胞（图1）.
A： 对照组大鼠； B： 单侧PD模型组大鼠健侧； C： 单侧PD模型组大鼠毁损侧.
图1大鼠纹状体电镜图像TEM ×8000 （略）
2.599mTc TRODAT1在PD模型鼠脑内分布毁损术后14 d，单侧PD模型组大鼠2 h双侧纹状体比值（L/R＝3.768±0.212）明显高于对照组（L/R=1.008±0.009）（t=7.32, P<0.05）. 数据经秩和检验显示，各个时间段下，各组ST/CB均数差异均有统计学意义(P<0.01). 两两比较显示，各个时间段下，毁损侧与对照组、单侧PD模型组健侧和多发性腔梗模型组纹状体摄取比值ST/CB比较，差异均有统计学意义(P<0.01)；而对照组、单侧PD模型组健侧和多发性腔梗模型组一侧纹状体摄取比值ST/CB之间比较，差异均无统计学意义(P>0.05，表2).
表2各组大鼠纹状体对99mTcTRODAT1摄取比值 ST/CB（略）
bP<0.01 vs对照、单侧PD模型健侧、腔梗模型.
3讨论
PD的病理、病生特征是黑质致密部位DA能神经元变性，突触前递质量发生改变，不仅在突触后膜的相应受体会出现变化，而且突触前膜的DAT也会发生一系列相应的代偿性变化，并且DAT的变化要比突触后膜受体的变化更为敏感、直接，因而DAT核素分布/显像对评价DA能神经元突触前功能及对PD的早期诊断有重要价值［2］.
99mTcTRODAT1，属DAT类显像剂，DAT是一种位于DA能神经元突触前膜的膜蛋白，属于Na+, Cl-依赖性转运体基因家族［3］. 其功能是在DA能神经元发放冲动后，迅速摄取突触间隙约占总量3/4的DA，以终止DA能神经元间的信号传递［4］.
本研究进行的99mTcTRODAT1动物脑内放射性分布实验结果表明，正常大鼠纹状体明显摄取99mTcTRODAT1，多发性腔梗模型组与对照组无大差异. PD模型大鼠术后14 d健侧纹状体摄取明显高于毁损侧. PD模型鼠2 h双侧纹状体比值明显高于对照组，毁损侧较对侧明显减低. 试验显示99mTcTRODAT1在对照组纹状体放射性明显浓聚，在单侧PD模型组毁损侧放射性分布明显较健侧减低，从而证明了99mTcTRODAT1显像剂对PD的诊断有特异性.
脑内受体的量仅在1×10-12 mol/g水平，CT及MRI无法显示这种受体及转运蛋白的变化，所以PD早期CT及MR检查往往正常，只是晚期，MR在<0.5T的低场强下，显示弥漫性脑萎缩，此时患者已有明显临床症状，对药物反映不佳［5］. 我们在电镜下只是观察到了多巴胺神经细胞缺失，同样未见突触前后及转运蛋白受体变化. 目前早期PD的诊断依靠18F多巴PET显像，而99mTcTRODAT1因其利用99mTc标记，易得，能客观反映DAT的变化情况，可作为前者可靠的替代品，从而为神经系统显像达到真正意义的分子水平［6-7］打下良好基础，对早期PD的诊断很有帮助.
【】
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