人肥大细胞羧基肽酶的单抗2A9识别表位的预测和鉴定
【关键词】 肥大细胞羧基肽酶；表位,B淋巴细胞；预测；基因表达
【Abstract】 AIM: To predict the B cell epitope of human mast cell carboxypeptidase （hMCCP）and identify the region of B cell epitope recognized by monoclonal antibody （mAb）against hMCCP. METHODS: The B cell epitopes were predicted by secondary structure (SOMPA, selfoptimized prediction method with alignment), hydrophilicity（Hopp&Woods）, antigenic index (JamesonWolf) and surface probability plot (Emini). The cDNA encoding the N terminal 1～111(P1P2), 97～202(P3P4) and 1～202(P1P4)Aa of hMCCP was amplified by PCR and cloned into prokaryotic expression vector pET44 Ek/LIC. After induction with IPTG, the recombinant fusion protein was expressed and analyzed by SDSPAGE. For the epitope analysis, mAb 2A9 was used to react with the fusion protein by Western blot. RESULTS: The predicted B cell epitopes were probably located in N terminal 1～202 Aa. mAb 2A9 could react with fusion proteins which contained P1P4 and P3P4 in Western blot analysis, but not react with fusion proteins containing P1P2. CONCLUSION: Prediction of the B cell epitope for hMCCP can provide a base for the studies of structure and function of hMCCP. The epitope recognized by mAb 2A9 is located in 112202 Aa of hMCCP.
【Keywords】 mast cell carboxypeptidase（MCCP）, epitopes, Blymphocyte, forecasting, gene expression
【摘要】 目的： 分析人肥大细胞羧基肽酶（hMCCP）的单克隆抗体（mAb）2A9识别表位所在区域. 方法： 根据肥大细胞hMCCP的二级结构、亲水性、表面可能性和抗原性指数，对hMCCP的B细胞表位进行预测. 依据预测结果，采用缺失突变的方法，分别扩增编码hMCCP N端第1～111(P1P2),97～202(P3P4)和1～202(P1P4)位氨基酸的cDNA，并构建重组原核表达载体pET44/P1P2、pET44/P3P4和pET44/P1P4. 用IPTG诱导表达融合蛋白，并对表达产物进行SDSPAGE和Western blot分析. 结果： B细胞表位预测结果显示，hMCCP的N 端第1～202位氨基酸含有多个潜在的B细胞表位. PCR扩增出的3个目的片段，其DNA序列同NCBI公布的序列完全一致. Western blot结果显示： E.coli BL21 (DE3)表达的融合蛋白P3P4和P1P4均与mAb 2A9反应；而融合蛋白P1P2与mAb 2A9不发生反应. 结论： 用多参数综合测评的方法，可获得满意的hMCCP B细胞表位预测结果，本研究中mAb 2A9识别的表位位于hMCCP的112202位氨基酸区域.
【关键词】 肥大细胞羧基肽酶；表位，B淋巴细胞；预测；基因表达
人肥大细胞羧基肽酶(human mast cell carboxypeptidase, hMCCP)是一种存在于结缔组织肥大细胞内的中性蛋白酶，约占肥大细胞蛋白总量的12%. 成熟的hMCCP是一种糖蛋白，含有308个氨基酸残基，相对分子质量为36 ku［1］. 尽管hMCCP与人羧基肽酶B的同源性为65 %,而与人胰腺羧基肽酶A的同源性仅为19 %，但hMCCP与胰腺羧基肽酶A均具有水解血管紧张素I的活性［2］. hMCCP作为肥大细胞释放的一种重要炎性介质，其生物学功能和在变态反应性疾病中所起的作用，目前尚不清楚. 有研究显示： 哮喘、药物过敏等变态反应疾病患者外周血嗜碱粒细胞中，hMCCP的表达明显增高［3］；羧基肽酶基因敲除小鼠肥大细胞表现为未成熟表型［4］. 我们在成功进行hMCCP原核表达的基础上［5］，以表达的重组蛋白为抗原制备了1株小鼠抗hMCCP mAb 2A9. 本研究旨在对hMCCP的B细胞表位进行预测, 并以此为依据，确定hMCCP被mAb 2A9识别的表位所在区域.
1材料和方法
1.1材料含hMCCP全长cDNA质粒由本室陈章权博士提供. E.coli DH 5α由本室保存，pET44 Ek/LIC载体购自Invitrogen公司，dNTP, pfu酶、DNA marker、蛋白质分子量标准和DNA回收试剂盒购自天为时代. SYBRGreen I核酸凝胶染料购自BMA公司,琼脂糖购自上海生工，DNA序列由上海博亚公司测定，IPTG购自TaKaRa公司. 小鼠抗hMCCP mAb 2A9为本室制备，过氧化物酶标记的山羊抗小鼠抗体购自Sigma公司. 化学发光试剂为Pierce公司产品.
1.2方法
1.2.1hMCCP B细胞表位预测用SOPMA服务器［6］ (http://npsapbil.ibcp.fr/cgibin/secpred_sopma.pl)预测hMCCP的二级结构; 用DNAStar protean软件预测hMCCP的亲水性（Hopp&Woods）［7］、表面可能性(Emini)［8］和抗原性指数（Jameson Wolf）［9］. 获得单参数预测结果后，对hMCCP蛋白的B细胞表位进行综合评价.
1.2.2重组表达载体的构建根据对hMCCP B细胞表位的综合评价结果、hMCCP序列和pET44 Ek/LIC载体的特点，设计如下引物：P1 （上游引物） 5′GAC GAC GAC AAG ATC ATC CCA GGC AGG CAC AGC TAC； P2 （下游引物） 5′GAG GAG AAG CCC GGT TTA AAC ATT GAA CAC AGG AAG； P3 （上游引物） 5′GAC GAC GAC AAG ATC CTC TTG GAC CGA ATG AAT； P4 （下游引物） 5′ GAG GAG AAG CCC GGT TTA CAA TAG CAT CTG GGA GTA G. 下划线部分为与pET44 Ek/LIC载体接头连接序列，其余部分为扩增hMCCP片段的引物. 引物由上海博亚合成. 分别以P1, P3为上游引物，P2, P4为下游引物，以含全长人hMCCP的质粒为模板，扩增编码hMCCP N 端第1～111 (P1P2)，97～202 (P3P4)，1～202 (P1P4) 位氨基酸的cDNA. 预期PCR产物大小分别为363, 348, 636 bp. 扩增条件为： 95℃ 2 min, 94℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 1 min，共25个循环，最后72℃延伸5 min. 回收的扩增产物与pET44 Ek/LIC连接并转化E.coli DH 5α. 将菌落PCR鉴定的阳性重组质粒送上海博亚进行序列测定. 阳性质粒分别命名为pET44/P1P2, pET44/P1P4和pET44/P3P4.
1.2.3重组融合蛋白的诱导表达将测序正确的重组质粒pET44/P1P2, pET44/P1P4和pET44/P3P4转化E.coli BL21 (DE3). 取单菌落接种于含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜. 培养物按1∶40稀释，并在37℃振荡培养至A600 nm＝0.3～0.5时，加入IPTG 至终浓度1 mmol/L, 37℃培养4 h后收获菌体，行100 g/L SDSPAGE分析目的蛋白的表达.
1.2.4抗hMCCP mAb识别hMCCP分子结构域的鉴定取IPTG诱导的菌体裂解液，参照《分子克隆》的方法，行100 g/L SDSPAGE. 电泳结束后用电转移装置将凝胶上的蛋白转移至聚偏二氟乙烯膜 (polyvinylidene difluoride, PVDF). 将膜在含50 g/L脱脂奶粉的PBS中封闭1 h，加入抗hMCCP mAb 2A9，室温过夜. PBS洗膜5 min×3次后,加入过氧化物酶标记的山羊抗小鼠抗体(1∶2000),室温下反应2 h. 洗膜3次后将膜浸于化学发光试剂中. Kodak X片曝光显像.
2结果
2.1hMCCP B细胞表位预测Hopp & Woods亲水性方案预测结果显示：亲水性较高的区域分别位于hMCCP N端第21～44, 49～60, 86～99, 153～176, 120～144, 210～225, 229～235, 268～275和280～294位氨基酸. 通过二级结构、抗原性指数和表面可能性等参数对以上高亲水性区域进行进一步分析，认为可能形成表位的区域位于hMCCP N端的第49～60, 86～99, 120～144, 153～176位氨基酸. 上述表位均为高亲水性区域，二级结构富含无规卷曲，具有较高的抗原性指数及表面可能性，符合表位分布特点. 各参数预测hMCCP B细胞表位的肽段位置见图1.
2.2重组表达载体的构建由于hMCCP N端1～202存在多个可能形成B细胞表位的区域，我们扩增了编码hMCCP N端第1～111（P1P2）, 97～202 (P3P4)和1～202 (P1P4)位氨基酸的cDNA，经10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，PCR产物与目的片段大小相符（图2）. 将上述PCR产物与原核表达载体pET44 Ek/LIC连接后得到重组质粒pET44/P1P2, pET44/P1P4和pET44/P3P4，菌落PCR和序列测定结果显示插入片段大小和核苷酸序列与设计序列完全一致.
2.3重组融合蛋白的表达SDSPAGE结果显示,在相对分子质量为73 , 72.5, 84 ku对应处，出现了新的表达条带,其相对分子量大小与理论值相符，说明成功获得了P1P2, P1P4和P3P4融合蛋白（图3）.
A： P1P2融合蛋白；B： P3P4融合蛋白；C： P1P41融合蛋白. 1： 蛋白marker；2： 含有重组质粒pET44/P1P2, pET44/P1P4和pET44/P3P4的重组菌BL21(DE3)未经IPTG诱导；3： 含有重组质粒pET44/P1P2, pET44/P1P4和pET44/P3P4的重组菌BL21(DE3)经IPTG诱导.
2.4抗hMCCP mAb识别hMCCP分子结构域的鉴定抗hMCCP mAb 2A9与融合蛋白P1P4和P3P4反应，而与融合蛋白P1P2不反应(图4). 表明抗hMCCP mAb 2A9的识别表位位于hMCCP的N端第112～202位氨基酸之间.
3讨论
以生物信息学为基础的B细胞表位预测是近年来建立起来的一种较先进的抗原表位研究方法. B细胞识别蛋白时是以其表面的B细胞受体(BCR)与蛋白的抗原表位(抗原决定簇)结合，此过程与抗原抗体的结合相同. 目前已有多种单参数预测模型和相应的分析软件成功应用于B细胞表位预测中［10］. 现已被人们认可并具有较好预测效果的方法主要有亲水性方案、可及性方案、抗原性方案、二级结构预测、可塑性方案和电荷分布方案. 本研究通过SOPMA服务器和相应的蛋白分析软件对hMCCP的B细胞表位进行了多参数预测. 尽管不同的预测方法，其预测的抗原表位的数目和所处的肽段位置有所不同，但综合几种方法的结果后，我们认为： 可能形成表位的区域位于hMCCP N端的第49～60, 86～99, 120～144, 153～176位氨基酸.
在蛋白质结构和功能的研究中，缺失突变是常用的手段之一. 我们根据hMCCP的B细胞表位预测结果，扩增其相应的缺失突变体序列，并构建重组原核表达载体，并以融合蛋白的形式表达缺失突变体蛋白. 另外，在设计本研究缺失突变体P1P2和P3P4时，在两者连接处有15个氨基酸的重叠. 这样，即使2A9的识别表位正好处于P1P2和P3P4的连接处，也可以得到较完整的表达. 我室曾用重组hMCCP和天然hMCCP，通过ELISA和Western blot，对抗hMCCP mAb 2A9进行了检测和鉴定（另文发表）. 由于Western blot可检测到天然和重组hMCCP与2A9的免疫沉淀反应，我们推测2A9所识别的抗原表位可能为一线性表位. 本研究中，根据对hMCCP B细胞表位的预测结果，首先表达了含P1P4的融合蛋白，并在确定2A9与P1P4反应后，我们又将P1P4分为P1P2和P3P4，分别进行表达. 通过2A9与P1P2和P3P4的Western blot结果，将2A9的识别位点进一步确定在hMCCP N端第112202位Aa之间.
尽管肥大细胞活化时释放大量的hMCCP，但有关hMCCP在变态反应性疾病中的病理生理作用，目前尚不清楚. 本研究根据hMCCP的B细胞表位预测结果，成功表达了hMCCP的缺失突变体，并将2A9识别hMCCP的区域初步确定在其N端第112202位氨基酸. 上述结果为进一步研究hMCCP结构与功能的关系奠定了基础.
【】
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