支气管上皮细胞和嗜酸粒细胞的不同培养方式对IL

       作者：王成彬，黄振国，叶伟基，李洛谊，鲍依稀，童红莉，田亚平，林伟基

【关键词】  支气管；上皮细胞；嗜酸细胞；白细胞介素

    【Abstract】 AIM: To investigate the effect of different culture systems on IL6 release in model of coculture of human bronchial epithelial cells and eosinophils. METHODS: Human bronchial epithelial cells and eosinophils were cultured or cocultured in separation, contact and Matrigel system. IL6 release in different culture systems of bronchial epithelial cells and eosinophils was determined by enzymelinked immunosorbent assay (ELISA). RESULTS: Compared with the sum of IL6 in culture supernatants of bronchial epithelial cells and eosinophils alone, IL6 release exhibited a synergistic effects in coculture of the two kinds of cells in a well separated into up and down chambers by the screen, that could sustain the culture supernatant across ［(107±10) ng/L  vs (388±40) ng/L, P<0.001］. But IL6 release in coculture of the two kinds of cells separated using screen was less than that in their contact  coculture ［(388±40) ng/L vs (1270±131) ng/L, P<0.001)］. Coculture of bronchial epithelial cells and eosinophils in Matrigel system led to asignificant elevation of IL6 release compared with that in general contact  coculture of the two kinds of cells ［(2076±165) ng/L vs (1270±131) ng/L, P<0.01)］. CONCLUSION: Human bronchial epithelial cells and eosinophils can be activated to release IL6 by contacting each other and mediators that they released in coculture.

    【Keywords】 bronchi; epithelial cells; eosinophils;  interleukin6

    【摘要】 目的： 以支气管上皮细胞和嗜酸粒细胞共培养为实验模型，探讨不同培养方式对IL6释放的影响. 方法： 将支气管上皮细胞和嗜酸粒细胞分别单独培养、接触共同培养、分隔共同培养（用分隔膜将两种细胞分隔在上、下两个池中不接触培养，两池中的培养液可以自由通过分隔膜孔）和在Matrigel中共同培养. 两种细胞在不同培养条件下释放的IL6应用酶联免疫吸附试验方法定量. 结果： 支气管上皮细皮与嗜酸粒细胞在同一培养孔中分隔共同培养时其IL6释放量远高于两种细胞分别在两个培养孔中独自培养后上清液中IL6之和［(388±40) ng/L vs (107±10) ng/L, P<0.001］.而两种细胞在同一培养孔中（没有隔膜分隔）接触共同培养，其IL6释放量又远高于其分隔培养［(1270±131) ng/L vs (388±40) ng/L, P<0.001］；将上述两种细胞在Matrigel中共培养,其IL6释放又显著高于其在非Matrigel中的培养 ［(2076±165) ng/L vs (1270±131) ng/L, P<0.01］. 结论： 支气管上皮细胞与嗜酸粒细胞共同培养过程中可受到相互接触和其在培养过程中所释放的某些物质的活化，从而增加多功能细胞因子IL6的释放.

    【关健词】 支气管；上皮细胞；嗜酸细胞；白细胞介素6

     支气管上皮可通过其黏膜纤毛系统发挥对外源性物质（尘埃、病原微生物等）的屏障功能. 但最近的研究结果表明，在多种气道炎性疾病过程中，支气管上皮细胞可增加释放IL6, IL8,肿瘤坏死因子（TNF）α等炎性介质［1-2］，这些炎性介质对淋巴细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸粒细胞等炎性细胞具有活化和趋化作用［3-4］. 活化后的嗜酸粒细胞可释放多种炎性介质，因而被认为是过敏性炎症反应的主要作用细胞［5］. IL6是一种具有多功能作用的细胞因子，其作为炎性细胞因子，可诱导炎症急性期蛋白的合成并可通过对T辅助淋巴细胞的活化和分化而介导不同的免疫和炎症反应［6］. 因此，IL6合成和释放对气道炎症的启动、及转归都具有十分重要的作用. 我们用人支气管上皮细胞系BEAS2B细胞和外周血嗜酸性粒细胞共培养为实验模型，观察两种细胞不同培养方式对IL6释放的影响，探讨炎性细胞从外周血迁移至支气管上皮产生黏膜炎症反应的机制.

    1材料和方法

    1.1材料支气管上皮细胞系BEAS2B细胞为12SV40腺病毒转染的正常人支气管上皮细胞，购于美国ATCC公司；DMEM/F12, RPMI 1640细胞培养液购自美国Gibco Invitrogen公司；密度1.082 kg/L Percoll溶液: 混合87.92 mL Percoll 原液(密度1.130 kg/L, 瑞典Amersham 公司产品)，15 mL 1.5 mol/L NaCl和 47.1 mL去离子水；抗CD16抗体磁珠和细胞磁性分离系统（MACS）购自德国Miltenyi Biotec 公司；Matrigel和细胞转膜插槽（孔径0.4 μm）购于美国BD公司；IL6 ELISA测定试剂盒购于 美国Bio Source公司，新鲜人全血由香港红十字会输血服务中心提供.

    1.2方法

    1.2.1嗜酸粒细胞的分离新鲜人全血通过密度为1.082 kg/L Percoll溶液离心分层，去除淋巴细胞层后用冰浴去离子水裂解红细胞，所剩嗜中、酸粒细胞与抗CD16抗体磁珠反应使细胞表面带有CD16蛋白质的嗜中粒细胞与磁珠结合. 当嗜中、酸粒细胞混悬液通过磁性分离柱时，由于磁性作用使结合在磁珠上的嗜中粒细胞吸附于分离柱上，而表面不表达CD16的嗜酸粒细胞则可顺利通过分离柱. 分离后的嗜酸粒细胞用伊红染色鉴定其纯度，计数并调整到适当浓度，再悬浮于含100 mL/L小牛血清的RPMI 1640细胞培养液中待用.

    1.2.2BEAS2B细胞的培养BEAS2B细胞置于含100 mL/L小牛血清的DMEM/F12 细胞培养液中，37℃, 50 mL/L CO2孵育.

    1.2.3BEAS2B细胞与嗜酸粒细胞接触共培养待BEAS2B细胞贴壁生长到形成单层（1.5×105），将细胞培养液换成含1×106嗜酸粒细胞加有100 mL/L小牛血清的RPMI 1640细胞培养液共培养.

    1.2.4BEAS2B细胞与嗜酸粒细胞分隔共培养待BEAS2B细胞贴壁生长到形成单层（1.5×105），细胞培养液换成含有100 mL/L小牛血清的RPMI 1640培养液，将带有细胞分隔膜的插槽（膜孔径0.4 μm，可阻止嗜酸粒细胞通过膜进入下层培养池与BEAS2B接触，但不影响细胞培养液及细胞代谢产物交换）置入细胞培养孔中将之分隔成上、下两个细胞培养池，加入1×106嗜酸粒细胞到上层培养池与BEAS2B细胞分隔培养.

    1.2.5BEAS2B细胞与嗜酸粒细胞在Matrigel中共培养触合的BEAS2B细胞（1.5×105）与1×106嗜酸粒细胞在Matrigel中共培养.

    1.2.6细胞培养上清液的收集将嗜酸粒细胞和BEAS2B细胞分别或共培养15 h，收集培养上清液，510 g, 4℃离心10 min，分离无细胞上清液并立即置于-80℃保存.

    1.2.7IL6的测定细胞培养上清液中IL6用ELISA方法定量.

    统计学处理：  所有实验均重复3次（n=3），数据用x±s表示，两种细胞在不同培养体系中所释放IL6量的比较应采用方差分析，并用SPSS统计软件进行处理. P<0.05表示差异有统计学意义.

    2结果

    2.1嗜酸粒细胞与支气管上皮细胞不同方式的共培养BEAS2B细胞贴壁生长到融合后加入嗜酸粒细胞与其共培养，嗜酸粒细胞可均匀分散于BEAS2B表面与之直接接触（图1A）. 在BEAS2B细胞与嗜酸粒细胞分隔共培养体系中，未见嗜酸粒细胞从上层细胞培养池透过插槽隔膜进入下层细胞培养池（图1B）. 当BEAS2B细胞与嗜酸粒细胞在Matrigel体系中接触共培养时，BEAS2B细胞单细胞面与嗜酸粒细胞接触数量增加（图1C）.

    2.2嗜酸粒细胞与支气管上皮细胞分隔共培养对IL6释放的影响用分隔膜将嗜酸粒细胞与BEAS2B细胞分隔在同一孔中共培养15 h，其共培养上清液中IL6浓度显著高于两种细胞分别单独培养之和［（388±40） ng/L vs （107±10） ng/L, P<0.001］.

    2.3嗜酸粒细胞与支气管上皮细胞接触共培养对IL6释放的影响嗜酸性粒细胞和BEAS2B细胞接触共培养15 h，其IL6释放量显著高于两种细胞分隔共培养［(1270±131) ng/L vs  (388±40)ng/L］, P<0.001］.

    2.4嗜酸粒细胞与支气管上皮细胞在Matrigel中共培养对IL6释放的影响 嗜酸粒细胞与支气管上皮细胞在Matrigel中共培养15 h，培养上清液中IL6浓度又大大高于两种细胞接触共培养［（2076±165） ng/L  vs (1270±131) ng/L, P<0.01］.

    3讨论

    在过敏性哮喘过程中，活化后的大量炎性细胞特别是嗜酸粒细胞向气道炎症部位迁移，其在气道上皮释放的各种炎性介质不仅能够造成支气管上皮细胞损伤，介导气道上皮修复和气道重建，还可进一步活化和趋化炎性细胞的迁移，调控过敏性气道炎症反应过程［3-5］. 近年来的大量研究结果表明，支气管上皮受到外源微生物、蛋白酶、过敏原蛋白、细胞因子等刺激后，可释放多种炎性介质［7-8］，因此其在气道炎性疾病中可能具有重要的免疫调控功能，而此种功能的A： 两种细胞接触共培养，左下图为嗜酸粒细胞，右上图为支气管上皮细胞×100；B： 两种细胞分隔共培养；C： 两种细胞在Matrigel体系中共培养，左下图为嗜酸粒细胞，右上图为支气管上皮细胞×100.

    图1嗜酸粒细胞与支气管上皮细胞不同方式的共培养

    启动除与外源性物质刺激有关外，还可能与炎性细胞同其接触及炎性细胞分泌的炎性介质对其活化有关. 我们的实验结果表明，在过敏性炎症反应中具有重要作用的嗜酸粒细胞与支气管上皮细胞系BEAS2B细胞接触共培养,可显著增加炎性细胞因子IL6的释放，这就证明了两种细胞在接触培养过程中可发生活化作用. 而当嗜酸粒细胞与支气管上皮细胞在同一培养槽中经微孔膜相隔共培养过程中，IL6释放高于两种细胞单独培养. 在此培养体系中，由于转膜插槽中微孔膜的孔径小于嗜酸粒细胞直径，因而在上层培养池中的嗜酸粒细胞不能透过微孔膜进入下层培养池与BEAS2B细胞发生接触，但微孔膜的孔径不影响细胞培养过程中所分泌的细胞因子等大分子蛋白质通过. 本文的实验结果说明，两种细胞分隔共培养过程中所释放的介质可刺激所培养细胞释放IL6. 但在上述实验中去除分隔膜，使两种细胞接触培养，结果细胞培养上清液中IL6浓度远远高于两种细胞分隔共培养体系. 这就意味着两种细胞相互接触对其活化和细胞间的信号转导可能更具意义. 上述两种细胞在接触培养过程中由于BEAS2B细胞是贴壁生长，因而影响其与嗜酸粒细胞共培养过程中的接触面积，当两种细胞在Matrigel体系中共培养时，由于Matrigel分子间具有一定的空隙，从而使得嗜酸粒细胞在共培养过程中可以从不同的侧面与BEAS2B细胞接触，从而大大提高了两种细胞共培养过程中相互活化和信号转导的效率，结果导致IL6释放的增加. 从本文的实验结果可以得出如下结论：炎性细胞从外周血迁移到支气管上皮与支气管上皮细胞接触，对两种细胞之间的相互活化并释放炎性介质调控气道炎性反应过程具有重要意义，而两种细胞活化后释放的炎性介质可进一步加强两种细胞的活化.

    【】

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