复方中药丹星通络汤对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用
【关键词】 复方丹星通络汤；脑缺血;再灌注损伤;乳酸脱氢酶；FAS
【Abstract】 AIM: To study the neuroprotection and mechanism of danxingtongluotang （DX） on rats with focal cerebral ischemiareperfusion (I/R) injury. METHODS: Forty SD male rats were divided randomly into 4 groups: control group, shamoperated + normal saline (NS); model group, cerebral I/R+NS; nimodipine group, I/R+nimodipine; DX group, I/R+DX. The 4 groups were fed with NS, nimodipine or DX for consecutive 5 d. Focal I/R models were made with sutureocclusion method. After cerebral ischemia for 2 h and then reperfusion for 24 h, the activity of LDH in serum was measured and the expression of FAS in brain tissue was detected. RESULTS: After cerebral I/R, the activity of LDH in serum of model group increased significantly as compared with control group (P<0.05); the activity of LDH in nimodipine group and DX group decreased obviously and was lower than that in model group （P<0.05, P<0.01）, there was no significant difference between the activity of nimodipine group and DX group (P>0.05). Expression of FAS in brain tissue of model group increased significantly as compared with that in control, nimodipine and DX groups (P<0.01); the expression of FAS in brain tissue of nimodipine and DX groups was decreased significantly as compared with that in model group（P<0.01）; the level of DX group was lower than that of nimodipine group. CONCLUSION: DX has an obvious protection against I/R injury probably through decreasing the activity of LDH and the expression of FAS in brain tissue.
【Keywords】 danxingtongluotang; cerebral ischemia; reperfusion injury; LDH； FAS
【摘要】 目的: 探讨复方中药丹星通络汤对大鼠局灶性脑缺血再灌注脑损伤的保护作用及机制. 方法: 40只大鼠随机分为4组，即对照组(假手术+生理盐水)、模型组(缺血再灌注+生理盐水)、尼莫地平组(缺血再灌注+尼莫地平)、复方丹星通络汤组(缺血再灌注+复方丹星通络汤). 每组分别连续5 d灌胃口服生理盐水、尼莫地平、复方丹星通络汤. 线栓法制作局灶性脑缺血再灌注模型，缺血2 h后再灌注24 h. 检测血清乳酸脱氢酶（LDH）活力、大脑FAS细胞表达. 结果:模型组大鼠局灶性脑缺血再灌注后血清LDH活力明显高于对照组（P<0.05）, 尼莫地平组、复方丹星通络汤组血清中LDH活力明显降低（尼莫地平组vs 模型组，P<0.01； 复方丹星通络汤组vs模型组，P<0.05），尼莫地平组和复方丹星通络汤组间无显著性差异（P>0.05）. 模型组大脑FAS细胞表达明显高于对照，尼莫地平，复方丹星通络汤组（P<0.01）,与模型组比较，尼莫地平组、复方丹星通络汤组脑组织FAS阳性细胞数表达显著下调（P<0.01）,复方丹星通络汤组明显低于尼莫地平组（P<0.01）. 结论: 复方丹星通络汤可有效地防止FAS及LDH升高, 对脑缺血再灌注脑损伤有显著保护作用.
【关键词】 复方丹星通络汤；脑缺血;再灌注损伤;乳酸脱氢酶；FAS
0引言
复方中药丹星通络汤是在清热化痰、活血通络中风病的理论基础上，化裁精简的临床经验方，由丹参、胆南星、三七等药组成. 我们观察了该药对实验性大鼠局灶性脑缺血再灌注脑损伤的保护作用，并初步分析了其作用机制, 为临床防治中风提供实验依据.
1材料和方法
1.1材料复方丹星通络汤生药由大连医科大学第二附属中药局代购，常规水煎，浓缩至1 kg/L（生药量）的溶液备用. 尼莫地平片（山西亚宝药业有限公司）；FAS（NEO MARKERS公司），稀释度为1∶150；Sp即用型工作试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司);多聚甲醛（天津市化学试剂厂）. 721分光光度计(上海精密仪器有限公司)；802离心机(上海手术器械厂)；微量天平：北京赛多利仪器系统有限公司；荧光显微镜BX51：日本Olympus；数码相机cool PI995:日本Nikon；超薄切片机(上海手术器械厂)；SHZ300多用途水浴恒温箱（江苏太仓市试验设备厂）. 40 g/L多聚甲醛固定液：900 mL蒸馏水中加入Na2HPO4・12H2O 36 g，多聚甲醛40 g，加热搅拌（勿使其沸腾）,待其完全溶解后加入Na2HPO4・2H2O 3 g，定容至1000 mL；PBS：900 mL蒸馏水中加入NaCl 9 g，Na2HPO4・12H2O 6 g，Na2HPO4・2H2O 0.4 g，定容至1000 mL；DAB显色剂：临用先配. 6 mg DAB粉末加入10 mL PBS，充分研磨后，加入30 mL/L H2O 230 μL混匀，避光.
1.2方法SD大鼠体质量约200～250 g，雄性，由大连医科大学实验动物中心提供. 大鼠40只随机分为4组，即对照组、模型组、尼莫地平组及丹星通络汤组. 对照组和模型组分别灌胃生理盐水20 mL/kg，尼莫地平组20 mL/kg灌胃（浓度1 g/L），丹星通络汤组灌胃复方丹星通络汤7.5 mL/kg. 连续灌胃5 d，最后灌胃2 h后线栓法造模，用100 mL/L水合氯醛(3 mL／kg)腹腔麻醉，取仰卧位固定在手术台上行右侧大脑中动脉阻断术(MCAO)，颈部正中切开，分离出右侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉及翼颚动脉. 先结扎翼颚动脉的近心端，防止鱼线插入翼颚动脉，然后在颈总动脉前壁剪一小口，插入鱼线，经颈总动脉穿入颈内动脉，继续向前推进直到感觉有轻微阻力，提示尼龙线的头部已经达到了颈内动脉的分叉处,即大脑中动脉的起始部. 颈总动脉分叉处切口，插入直径0.22 mm鱼线，进入颈内动脉入颅，深度为17～20 cm，至大脑前动脉，阻断大脑中动脉所有的血流来源. 扎紧备线，外留1 cm长线头，缝合皮肤. 缺血2 h后再灌注，勿需再次麻醉和切开皮肤，轻轻提拉所留线头至阻力时提示鱼线头端已至颈总动脉切口处，血液再通，再灌注24 h. 再灌前参照Longa等方法进行5 分制神经功能评分(0分:无明显神经病学症状；1分:不能完全伸展左前肢；2分:向左侧旋转；3分:向左侧倾倒；4分:不能自行行走). 评分为1～3分者模型制备成功，余者剔除. 不足预定数额者按照随机抽样原则补齐动物并重新造模. 对照组栓线不插入颈内动脉颅内段， 其余同以上.
血清中LDH活力的测定：脑缺血、再灌注模型再灌24 h，腹主动脉取血5 mL，高速离心机离心取上清液2 mL，编号,2～4℃冷藏，制备血清标本；将备好的血清用分光光度剂测定测定管A值、测空管A值、标空管A值、标准管A值，利用公式，血清中LDH活力. 血清中LDH活力=（测定管A值-测空管A值）/（标准管A值-标空管A值）×2000,标准管A值=0.1899, 标空管A值=0.085, 测空管A值=0.12.
大鼠脑组织FAS的平均阳性细胞数分析：将各组大鼠深度麻醉，迅速打开胸腔，左心室插管经升主动脉快速灌注生理盐水200 mL，再持续灌注0.1 mol/L磷酸缓冲液配制的40 g/L多聚甲醛固定液300 mL，断头取脑，再用相同固定液后固定1 h，制备脑组织； 石蜡包埋、切片、防脱片处理；分别取与HE染色相邻的切片进行FAS免疫组化检测：免疫组化采用SP法，DAB显色；结果评定：用光学显微镜（×400），观察每个视野中FAS蛋白表达数目（胞质棕黄色为阳性细胞），每组随机数5个视野取其均值作为本组的代表值.
统计学处理：实验结果以x±s表示, 运用SPSS 11.5统计学软件进行KruskalWallis检验，两组间比较用Wilcoxon秩和检验. 以P<0.05为有统计学差异.
2结果
2.1血清中LDH活力大鼠模型组血清中LDH活力明显高于对照组（P<0.05）. 与模型组比较，尼莫地平及丹星通络汤组血清中LDH活力明显降低（P<0.01,P<0.05），尼莫地平与丹星通络汤组血清中LDH活力下降比较，无统计学差异（P>0.05，表1）. 表1局灶性脑缺血再灌注血清中LDH活力, 脑组织FAS阳性细胞数（略）
2.2各组大鼠脑组织FAS的平均阳性细胞数分析由免疫组化切片可见，与对照组比较，大鼠模型组、尼莫地平组、丹星通络汤组脑组织FAS阳性细胞数表达显著上调（P<0.01）. 与模型组比较，尼莫地平组、丹星通络汤组脑组织FAS阳性细胞数表达显著下调，与模型组比较，均有统计学差异（P<0.01）,尼莫地平组与丹星通络汤组比较，以丹星通络汤组差异最为明显（P<0.01，表1，图1).
3讨论
丹星通络汤对缺血再灌注损伤的保护作用，可能和以下作用机制有关:
3.1缺血再灌注血清乳酸脱氢酶的改变当脑缺血引起细胞损伤后，大量存在于神经元细胞的胞质和线粒体中LDH可释放到细胞间隙，再扩散人脑脊液，通过受损的血脑屏障进入血液［1］. LDH酶活性、Na+K+ATP酶活性的测定可作为受损部位能量代谢改变的指标，其质与量的改变，直接影响到机体的能量代谢，当各组织器官受损时，可见LDH酶活性增高，Na+K+ATP酶活性受抑制.
中医认为，急性脑缺血的病理产物如“瘀毒、热毒、痰毒”等，统称为“毒邪”，造成邪气亢盛，败坏形体，脏腑功能和气血运行失常，机体内的生理或病理产物不能及时排出，这与西医的脑梗死后脑组织缺血细胞坏死、缺氧、无氧代谢增加致使机体血清LDH等酶从细胞释出的理论相一致. 本研究表明，丹星活络汤和尼莫地平均明显降低血清中LDH活力（P<0.05或P<0.01）. 丹星通络汤以丹参、胆南星为主，活血通络，清热化痰.
3.2缺血再灌注脑细胞FAS的改变在缺血再灌注神经元死亡中,坏死与凋亡是共存的［2］,坏死多发生于急性期,而继发性或迟发性死亡则以凋亡为主.中药对促进细胞内的自身修复,预防神经元的损伤,减少处在半暗区的神经细胞的死亡是有很大优势的［3-4］. 研究［5-6］表明FAS蛋白在许多因缺血缺氧而致的凋亡组织中均呈阳性表达. 当细胞表达FAS时，FAS与天然配体FASＬ或FAS抗体结合后可向细胞内传递死亡信号， FAS死亡区发生交联,产生神经酰胺,通过某种途径,激活内源性核酸内切酶,使细胞核DNA断裂,引起表达FAS的靶细胞在数小时内凋亡［7］. 本研究结果显示,应用尼莫地平、中药后脑组织FAS阳性细胞数表达显著下调（P<0.01），中药效果优于尼莫地平（P<0.01）.
祖国医学认为中风急性期以痰浊和淤血为本. 复方丹星通络汤以丹参、胆南星为主，活血通络、清热化痰［8］，大黄、黄芩泻热毒、导阻滞为辅，白术泽泻清热化痰、健脾燥湿，黄芪防风益气固表，元参葛根补阳解肌，槐花、三七、川穹、红花化瘀通络、温经活血，在不同时期对中风病均有作用. 我们发现复方丹星通络汤可以明显降低局灶性脑缺血再灌注动物血清中LDH活力，抑制脑组织FAS 蛋白表达, 在脑缺血性疾病的临床治疗中是很有意义和应用价值的.
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