邻苯二甲酸酯类对雄性生殖系统的毒性作用

【关键词】  邻苯二甲酸酯类化合物；生殖器,男（雄）性；基因

　　　0引言
 
　　对邻苯二甲酸酯类的生殖毒性研究，始于上世纪80年代. 通过近20 a的大量研究，包括动物及体外实验，证实了邻苯二甲酸酯类的生殖毒性，并得出相应的结论，如剂量－效应关系（最小无影响剂量－NOAEL），毒性机制（抗雄性激素物质作用），以及对基因表达的影响等等. 而对基因表达作用的研究，主要集中于20世纪90年代末期至今. 本文则对此进行相关的回顾.

　　1邻苯二甲酸酯类化合物的雄性生殖系统毒性研究现状

　　邻苯二甲酸酯(phthalate esters, PEs)是一类脂溶性人工合成有机化合物，主要有邻苯二甲酸二异辛酯（DEHP），邻苯二甲酸二正酯（DBP），邻苯二甲酸丁基苄酯（BBP），是全球性的环境污染物，广泛存在于空气、水体、土壤及生物体内. 该类化合物与我们的日常生活密切相关，可通过饮水、进食、皮肤接触(化妆品)和呼吸进入人体，对人体健康产生不同程度的危害作用. 在对啮齿类动物的研究中发现PEs具有致癌、致畸、致突变的作用［1］，研究表明该类化合物具有抗雄性激素作用，而这类作用却和已知的经典抗雄性激素有一定的区别，主要表现在其或其代谢产物均不与雄激素受体（androgen receptor， AR）发生直接的激活或是拮抗作用，因而认为其可能具有类雌激素的活性，从而可导致对雄性生殖系统的毒性作用.

　　目前国外对PEs类化合物的研究已得到了相当的重视，从最初的毒研究、生态学调查，到目前的生化学，分子生物学水平的研究，具有成系统、范围广、层次深的特点，而我国的研究主要集中在一些生态学的调查取样，以及基础的毒理及毒性研究，如剂量－效应研究［2］.

　　2PEs类化合物对雄性生殖系统毒性作用

　　2.1对雄性胚胎的生殖系统发育的影响 对雄性胚胎的毒性的研究主要集中于对啮齿类动物（大鼠、小鼠、兔）的研究［3-4］，发现在雄性生殖系统发育的关键期给予PEs类化合物，会造成雄性生殖系统发育的毒性，主要表现在对睾丸的毒性作用，其显著特征为leydig细胞的增生，然而此时睾酮的分泌及浓度却明显降低. 通过对AR及3β类固醇脱氢酶的分析，认为PEs类可能是引起了胚胎内雄激素的缺乏及AR的减少，从而引起了Leydig细胞的代偿性增生. 同时亦发现PEs类化合物对二氢睾酮及类胰岛素肽类激素依赖的生殖系统发育有不利影响，表现为外生殖器的畸形，泌尿生殖道距离的改变，乳头保留及睾丸下降的障碍.
 
　　2.2对出生后雄性生殖系统的影响实验发现DEHP仅能诱导未成年大鼠的睾丸毒性，且对PEs诱导的睾丸毒性，处于发育期的雄性大鼠的敏感程度高于成年雄性大鼠. PEs诱导的睾丸毒性,其优先靶细胞为Sertoli细胞 ,并发现在大剂量、快暴露时（6~12  h）即可发生. 体外研究发现PEs类不能诱导出与体内类似的睾丸毒性，而其单酯类的代谢产物则可以. 研究［5］表明某些PEs类化合物,如BBP可使小鼠睾丸曲细精管和各级生精细胞产生萎缩、变性，各级生精细胞减少或消失，精子活动率下降. 在另外一些研究中［6］,利用DEHP饮食饲喂SD大鼠，发现F0代在生育率及同窝仔数量上并无明显差别. 而F1代在高剂量时，则表现出明显的生育率下降（实验中20对只有1对例外），另可观察到明显的附睾和阴茎的畸形.
 
　　2.3抗雄性激素作用PEs类化合物具有抗雄性激素作用，通过对AR转录活性的测定，发现其作用机制与flutamide不同，并非AR的拮抗剂. 其对3种主要激素（抗穆勒氏管激素、睾酮、类胰岛素样肽类激素）依赖的雄性生殖系统发育均可产生不利影响.

　　3PEs类化合物对雄性生殖系统相关基因表达的作用

　　3.1PEs类化合物处理后睾丸内基因表达的研究［7］某些PEs类化合物(DEHP)处理过的成年雄性动物睾丸中，与细胞凋亡、萎缩相关的基因，以及顶体核酸酶、结缔组织生长因子、细胞粘连酶等均与正常组织有表达差异. 其中由于PEs类化合物引起睾丸组织学的变化，最明显的为睾丸的萎缩，而目前认为这种萎缩机制则是由于影响了正常的细胞凋亡过程. 因此，对细胞凋亡相关基因则有了详细的研究.
 
　　细胞凋亡过程包括以下级联：

　　Fas/FasL/FADD/caspase8/ caspase3

　　Apaf1/ caspase9/ caspase2

　　caspase11/ caspase3

　　FADD/ caspase10/ caspase6

　　由于该试验使用的DEHP剂量为口服、一次性剂量，因此未在受试动物中发现明显的组织病理学改变, 然而细胞凋亡过程发生变化. 实验发现，低剂量DEHP（20 mg/kg）引起bcl2(凋亡过程的关键基因)的增量调节，抑制了Apaf1/ caspase9/ caspase2级联，而与低剂量DEHP处理后相对应的睾丸组织学改变几乎不可见. 但当口服DEHP剂量增为2000 mg/kg时，凋亡过程的级联反应活跃，发现Fas/FasL/FADD/caspase8/ caspase3以及Apaf1/ caspase9/ caspase2级联反应增加而bcl2表达减少. 同时某些级联反应无明显变化，FADD/caspase10/caspase6 和 caspase11/caspase3，因此认为这两个级联反应与DEHP引起的正常细胞凋亡过程变化无关. 对基因的单个表达检测中，看出caspases2, 3, 9, 以及 bcl2的表达发生了明显的变化，并在DEHP2000mg/kg处理组中检测到10个与凋亡相关的基因，它们分别是caspases2, 3, 6, 8, 9, 11, bcl2, bcl2 联系的 protein X (bax), Fas,和 FasL. 检测结果为caspases2, 3, 8, 9, bax, Fas和FasL的表达明显增加，而bcl2明显减少.

 
　　3.2PEs类化合物对基因表达的影响这方面的研究集中于对影响雄性胚胎生殖系统发育的激素，影响性别分化的3种相关激素分别为抗穆勒氏管激素（AMHsertoil 细胞分泌），睾酮（Tsleydig细胞分泌），类胰岛素样肽类激素（leydig细胞分泌）. 首先，通过对PEs类化合物对这3种激素影响的研究，认为，PEs类化合物主要具有类似于雌激素的作用，和经典的AR抗体相比，可同时引起T和insl3的改变. 而引起insl3的改变则是经典的AR抗体所不具备的. insl3在雄性胚胎生殖系统发育中的主要作用为影响睾丸引带的发育.
 
　　其次，在一些实验中［8］，对妊娠14~18 d（GD14~18）的母鼠给予PEs类化合物DEHP, DBP, BBP口服，并与GD18 d时检查胎鼠睾丸中雄性激素的生成及insl3的表达. 实时RTPCR检测发现这些PEs类化合物同时影响了雄激素和insl3依赖的雄性生殖器官的发育，表现为雄性大鼠引带的完全不发育或是低常增生（延长或成丝状）insl3依赖，GD距离（泌尿生殖道距离）缩短、乳头保留、性附属器官发育不全或低常增生、尿道下裂等雄激素依赖，隐睾症insl3,雄激素共同依赖. 在另外的研究中［9］，对GD 18 d到出生后3 d的雄性大鼠持续给予PEs类化合物，发现大约50%的雄性后代出现引带的异常，虽然这种异常的发生低于附睾及睾丸异常发生率，然而却发现某些引带的异常发生时，并不伴有睾酮和AMH的异常. 由上认为PEs类化合物对insl3的影响可能是抑制了其基因的表达，并在PEs类化合物对insl3基因表达影响的研究中证实了这一点.

　　3.3PEs类化合物对睾酮合成中的基因表达作用［10］用实时RTPCR技术检测了睾酮生物合成中的一些基因，发现DBP处理后，SRB1, StAR, P450scc, 3βHSD, ckit, P450c17 的mRNA表达发生变化. 其中睾酮合成的起始基因P450scc, 3βHSD, P450c17的表达明显减少，而17βHSD则明显增长.

　　4PEs类化合物对人群危害的预防

　　PEs类化合物主要应用于增塑剂（如PVC材质）及化学溶剂（如化妆品、清洁剂等），某些医疗制品（如肾透析患者使用的透析袋以及医疗上使用的聚氯乙烯血袋）也含有一定量的该类化合物. 因此应当尽量避免使用含PEs类化合物的制品，使用这些含有PEs类化合物的制品时需要注意防护，使用后应妥善处理，对于长期接触PEs生产工艺的高危人群应重点加强防护，尤其是孕产妇及婴幼儿，更应该注意避免接触或使用含PEs类化合物的制品.

　　5展望
 
　　PEs类化合物对雄性生殖系统的毒性研究，目前还处于探索阶段，仍有许多问题尚待解决，如PEs类化合物在毒性作用过程中是否具有特异性的基因表达影响、对基因表达影响的剂量效应关系、对基因表达影响和生物组织学变化的对应关系、预防的药物途径等等，尤其是目前的研究多为动物或体外研究，对人类的影响基本上是通过评估或预测而得，因此PEs对人类生殖系统影响的具体途径，机制等都需要进一步的研究证实.

　　【】

　　［1］ Rochelle W, Christina B, Melissa C, et al. Reproductive toxicity evaluation of dietary butyl benzyl phthalate (BBP) in rats ［J］. Reprod Toxicol, 2004,18:241-264.

　　［2］ Zhang YH, Jiang XZ, Chen BH. Reproductive and developmental toxicity in F1 SpragueDawley male rats exposed to dinbutyl phthalate in utero and during lactation and determination of its NOAEL ［J］. Reprod Toxicol, 2004,18:669-676.

　　［3］ Higuchi, Jennifer S, Palmer L, et al. Effects of Dibutyl phthalate in male rabbits following in utero, adolescent, or postpubertal exposure ［J］.Toxicol Sci, 2003,72:301-313.

　　［4］ Gray J, Ostby J, Furr J, et al. Perinatal exposure to the phthalates DEHP, BBP, and DINP, but not DEP, DMP, or DOTP, alters sexual differentiation of the male rat ［J］. Toxicol Sci, 2000,58(2):350-365.

　　［5］ Janet YU, Kevin CR, Lan KN, et a1. Effect of butyl benzyl phthalate on reproduction and zine metabolism［J］. Toxicology, 2001,159:55-68.

　　［6］ Tanaka T. Reproductive and neurobehavioural toxicity study of bis(2ethylhexyl) phthalate (DEHP) administered to mice in the diet［J］. Food Chem Toxicol, 2002,40:1499-1506.

　　［7］ Kazuyasu K, Kaoru T, Masashi Y, et al. Gene expression analysis of the rat testis after treatment with di(2ethylhexyl) phthalate using cDNA microarray and realtime RTPCR［J］. Toxicol Appl Pharmacol, 2004,38:117-124.

　　［8］ Vickie SW, Christy L, Johnathan F, et al. Phthalate esterinduced gubernacular lesions are associated with reduced insl3 gene expression in the fetal rat testis［J］.  Toxicol Lett, 2004,146:207-215.

　　［9］ Gray LE Jr, Ostby J, Furr J, et al. Perinatal exposure to the phthalates DEHP, BBP, and DINP, but not DEP, DMP, or DOTP, alters sexual differentiation of the male rat［J］. Toxicol Sci, 2000,58(2):350-365.

　　［10］Norman JB, Suzanne LP, Duncan GW, et al. Quantitative changes in gene expression in fetal rat testes following exposure to di (nbutyl) phthalate［J］. Toxicol Sci, 2003,73:431-441.