脑血灵颗粒对脑出血大鼠炎症相关基因表达的影响

                 作者：郑安，叶钦勇，林求诚，黄华品，刘楠

【关键词】  脑血灵颗粒剂；脑出血；炎症；肿瘤坏死因子α；白细胞介素

　　Effect of Naoxueling granule on expressions of inflammationrelated genes after intracerebral hemorrhage in rats

　　【Abstract】 AIM: To investigate whether Naoxueling granule  can inhibit the inflammatory cascade reaction after intracerebral hemorrhage in rats. METHODS: Male SD rats received an infusion of 50  μL autologous blood into the right basal ganglia. The rats were randomly divided into sham operated group, model group, Huatuozaizao bolus group and Naoxueling granule group. The expressions of TNFα, IL1β, iNOS were observed by immunohistochemistry and in situ hybridization. RESULTS: The expressions of TNFα, IL1β,  iNOS all increased on 7  d after modeling . Naoxueling granule markedly decreased the expressions of  TNFα, IL1β, iNOS at the protein and mRNA levels. Compared with the model group, Huatuozaizao bolus group had no significant difference in the expressions of  TNFα, IL1β and iNOS. CONCLUSION: The mechanism of Naoxueling granule against intracerebral hemorrhage may be related to the effect of inhibiting inflammatory cascade reaction.

　　【Keywords】  naoxueling granule;   cerebral hemorrhage;      inflammation;   tumor necrosis factoralpha(TNFα);  interleukin1;  N itric oxide synthase

　　【摘要】  目的： 观察脑血灵颗粒对脑出血大鼠炎症相关基因（TNFα, IL1β, iNOS）表达的影响. 方法： 以自体血制作大鼠脑出血模型,实验组给予脑血灵颗粒,华佗再造丸为阳性对照组，模型对照组和假手术组给予生理盐水,通过免疫组化、原位杂交检测血肿周围组织TNFα, IL1β, iNOS等炎性基因的表达情况. 结果：在脑出血造模后7 d， 各组TNFα, IL1β, iNOS表达均明显上升，脑血灵颗粒剂可抑制血肿周围组织TNFα, IL1β合成的增加，并下调iNOS的活性，华佗再造丸组对TNFα, IL1β, iNOS表达未见明显作用. 结论： 脑血灵颗粒具有显著的抗炎症效应，从而对脑出血后的炎症损伤具有保护作用.

　　【关键词】  脑血灵颗粒剂；脑出血；炎症；肿瘤坏死因子α；白细胞介素1；一氧化氮合酶

　　0引言

　　近年来的研究表明，脑出血后血肿周围炎性细胞浸润及炎性细胞因子表达是出血后神经元继发性损伤的重要作用机制，其与脑缺血时类似，所不同的是，它们表达的高峰时间比脑缺血时间晚且持续时间更长，提示脑出血存在更长的抗炎时间窗. 我们通过观察脑血灵颗粒对脑出血大鼠三种重要的炎症相关基因（TNFα, IL1β, iNOS)表达的影响，探讨脑血灵颗粒剂对出血后继发性神经元损伤的保护作用机制.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　1.1.1动物实验用动物选择SD健康雄性大鼠32只， 体质量250～300 g，广东省医学实验动物中心提供，清洁级，动物许可证号： SCXK（粤）20030002，分笼饲养于安静舒适环境下，室温(22～25℃)，湿度20%.
 
　　1.1.2药物脑血灵颗粒，福建医科大学附属协和提供，由黄连、黄芩、生大黄、水蛭等组成，配制成含生药0.76 g/ml的供试液.
 
　　1.1.3主要仪器Narishige SR5N 立体定向注射仪；无锡医疗器械厂50 μL微量进样器；日本Olympus BX51 系统生物显微镜；德国LeicaCM1900恒温冰冻切片机；美国Alpha Imager 2200机全自动图像分析系统.
 
　　1.1.4主要试剂兔抗大鼠TNFα, IL1β, iNOS多克隆抗体、SABC免疫组化试剂盒、地高辛标记的TH, TNFα, IL1β, iNOS寡核苷酸探针、原位杂交专用盖玻片、原位杂交检测试剂盒(武汉博士德生物有限公司)，DAB显色剂（福州迈欣公司）.
 
　　1.2方法

　　1.2.1脑出血模型的制备将大鼠称体质量后，以100 mL/L水合氯醛300 mg/kg体质量腹腔注射麻醉后，腹位固定于立体定向仪上，参照脑立体定向图谱，顶部皮肤正中矢状切开，调节前囟与矢状缝在同一水平面上，穿刺部位定在前囟前0.2 mm，向右旁开3 mm处，进针深度为6 mm(尾壳核部位)，先用牙科钻钻约直径0.1 mm骨窗. 微量进样器取未肝素化的新鲜自体股动脉血50 μL，并结扎股动脉. 立即用进样器插入定位点在5 min内低压力(<13.33 kPa)缓慢注入自体股动脉血，注射后留针5 min，退出穿刺针后用医用胶封闭颅骨钻孔，缝皮消毒.
 
　　1.2.2分组大鼠随机分4组，每组8只， 脑血灵颗粒治疗组(36.15 g/kg，按体表面积计算相当于70 kg成年人临床生药用量的2倍）,华佗再造丸对照组(1.6 g/kg),模型对照组(等容积生理盐水),假手术组(等容积生理盐水).
 
　　1.2.3免疫组织化学检测TNFα, IL1β, iNOS阳性细胞的表达免疫组织化学染色步骤： ① 玻片恢复至室温，体积分数为0.003的H2O2室温作用30 min，阻断内源性过氧化物酶. ② 0.01 mol/L PBS洗3 min×3次；③ 山羊血清封闭，室温30 min；④ 甩去血清，分别加入一抗Bcl2（1∶200）、Caspase3（1∶300）37℃孵育2 h，0.01 mol/L PBS洗3 min×3次；⑤ 加生物素标记二抗， 37℃, 30 min，0.01 mol/L PBS洗3 min×3次；⑥ 加标记过氧化物酶的链酶素亲和素复合物，37℃， 20 min， 0.01 mol/L PBS洗3 min×4次；⑦ DAB显色， 适时终止， 自来水冲洗；⑧ 苏木素复染细胞核；⑨ 梯度乙醇脱水， 二甲苯透明， 中性树胶封固.
 
　　1.2.4原位杂交检测TNFα, IL1β, iNOS mRNA表达 Genebank查TNFα, IL1β, iNOS全长， Genefisher特异性设计探针，地高辛标记.

　　针对TNFα靶基因的mRNA序列为：

　　5′GAGCA CAGAA AGCAT GATCC GAGAT GTGGA3′

　　5′GAGTG ACAAG CCCGT AGCCC ACGTC GTAGC3′

　　5′GGGCA GGTCT ACTTT GGAGT CATTG CTCTG3′

　　针对IL1β靶基因的mRNA序列为：

　　5′ACAAA ATACC TGTGG CCTTG GGCCT CAAGG3′

　　5′GAAGA AGATG GAAAA GCGAT TTGTC TTCAA3′

　　5′CAACT GGTAC ATCAG CACCT CTCAA GCAGA3′

　　针对iNOS靶基因的mRNA序列为：

　　5′GGAAA AGGAC ATTAA CAACA ACGTG GAGAA3′

　　5′GACCA GAGGA CCCAG AGACA AGCCC ACCCC3′

　　5′CTTCC AGCTC AAGAG CCAGA AACGT TATCA3′

　　杂交操作步骤： ① 玻片恢复至室温，水化10 min. ② 新鲜配制体积分数为0.003 H2O2 1份＋纯甲醇50份混合，室温处理30 min，双蒸水洗5 min×3次. ③ 体积分数为0.03的柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶室温消化10 s，原位杂交用PBS洗5 min×3次，双蒸水洗1次. ④ 预杂交： 先在杂交盒底部加200 g/L甘油以保持湿度. 按每张切片加20 μL预杂交液，恒温箱37℃ 4 h. 吸去多余液体，不洗. ⑤ 杂交：按每张切片加20 μL杂交液，将原位杂交专用盖玻片盖在切片上，恒温箱37℃杂交过夜（16 h以上）. ⑥ 杂交后洗涤： 37℃左右水温的2×SSC洗涤5 min×2次；0.5×SSC洗涤15 min×1次；0.2×SSC洗涤15 min×1次. ⑦ 滴加封闭液：37℃ 30 min，甩去多余液体，不洗. ⑧ 滴加生物素化鼠抗地高辛：37℃ 60 min，原位杂交用PBS洗5 min×4次. ⑨ 滴加SABC： 37℃ 20 min. 原位杂交用PBS洗5 min×3次. ⑩ 滴加生物素化过氧化物酶：37℃ 20 min，原位杂交用PBS洗5 min×4次.  DAB显色，充分水洗. 梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固.
 
　　1.2.5图像分析从各组免疫组化及原位杂交连续切片中选取3张切片，每张切片选取3个视野， 采用Alpha Imager 2200全自动图像分析系统测灰度，得出平均阳性单位(PU).

 
　　统计学处理: 全部数据采用SPSS10.0统计软件包进行统计分析. 采用“均数±标准差”对数据进行统计描述. 各样本均数间比较采用方差分析，之前全部进行过方差齐性检验，检验水准取0.05.

　　2结果

　　2.1免疫组化检测脑血灵颗粒对术侧血肿周围TNFα, IL1β, iNOS阳性细胞表达的影响各造模组与假手术组比较，可见TNFα(图1A～C), IL1β, iNOS阳性细胞的表达水平均显著上调(表1). 与模型对照组比较，华佗再造丸组TNFα, IL1β, iNOS阳性细胞的表达水平有所下降，但无统计学意义. 而脑血灵组与模型对照组比较，TNFα, IL1β, iNOS阳性细胞的表达水平则显著下降，且脑血灵治疗组TNFα, IL1β, iNOS的表达水平均明显低于华佗再造丸组（P<0.01, 表1）.

　　2.2 原位杂交检测脑血灵颗粒对术侧血肿周围TNFα, IL1β, iNOS mRNA表达的影响各组之间TNFα, IL1β以及iNOS mRNA(表2,   图2A～C)的表达与免疫组化检测术侧血肿周围TNFα, IL1β, iNOS蛋白的表达规律一致.

　　A：假手术组；B： 模型对照组； C： 脑血灵治疗组组.

　　图1免疫组化检测TNFα阳性细胞表达×400（略）

　　表1各组TNFα, IL1β, iNOS阳性细胞PU值（略）

　　bP<0.01 vs模型对照,dP<0.01 vs华佗再造丸.

　　表2各组TNFα, IL1β, iNOS mRNA表达PU值（略）

　　bP<0.01 vs模型对照组；dP<0.01 vs华佗再造丸组.

　　A： 假手术组；B： 模型对照组；C： 脑血灵治疗组.

　　图2原位杂交检测iNOS mRNA 阳性细胞表达×400（略）

　　3讨论

　　近期对人类的研究和动物实验均表明脑出血后存在过度的炎症反应，其炎症反应较缺血性脑损伤更加明显，炎性反应程度与血肿周围脑组织水肿及继发性脑组织损害密切相关［1］. 与脑血管疾病关系最为密切的细胞因子主要有白细胞介素1β（IL1β）、肿瘤坏死因子α（TNFα）、一氧化氮合成酶（NOS）等. 既往研究结果表明，脑出血后炎性细胞因子的表达以及炎细胞浸润的规律与脑缺血类似，所不同的是，它们表达的高峰时间比脑缺血晚但持续时间更长［2］，提示脑出血存在更长的可利用的抗炎治疗“时间窗”，抑制出血后炎性因子的表达和炎细胞的浸润有可能成为防治脑出血后神经损伤新的有效途径.
 
　　IL1β是白细胞介素1家族的主要分泌形式，也是中枢神经系统中存在的主要形式. IL1β作为早期产生的细胞因子具有初始炎症反应并级联放大炎症过程的作用，诱导免疫活性细胞产生继发性细胞因子及其他炎症介质，导致炎症反应失控及引发细胞因子风暴，最终造成组织器官的损伤［3］. TNFα为TNF家族的主要亚型，是重要的促炎症细胞因子，可直接促进中性粒细胞向病灶区聚集，诱导白细胞、受损组织细胞释放更多的细胞因子，使炎症反应加剧［4］. iNOS途径高产量合成的NO表现为细胞毒性作用，参与了脑出血损伤的病理过程［5］. 炎性细胞因子在脑出血局部产生神经毒性作用的损伤机制非常复杂，包括： ① 直接或间接诱导神经毒性介质的产生，介导脑出血局部的炎症反应；② 破坏血脑屏障，增加其通透性，导致星形胶质细胞肿胀和变性；③ 释放各种神经毒性因子加重血脑屏障破坏和细胞膜损伤；④ 诱导合酶的表达，使合成增多；⑤ 刺激花生四烯酸的代谢，使自由基释放增加，产生和加重血管源性和细胞毒性脑水肿［6］.
 
　　本研究通过原位杂交、免疫组化等技术分别从mRNA转录及蛋白表达水平探讨了脑血灵颗粒剂对三种重要的炎症相关基因TNFα, IL1β, iNOS表达的影响. 结果发现：① 在脑出血造模后7 d，不论在mRNA水平，还是在蛋白水平， TNFα, IL1β, iNOS表达均明显上升，与国内外报道一致；② 华佗再造丸组对TNFα, IL1β, iNOS表达未见明显作用，说明其对急性脑出血无显著抗炎作用，我们认为与其处方组成以活血化瘀药为主药有明显关系；③ 中药复方脑血灵颗粒剂能抑制脑出血后TNFα, IL1β合成的增加，并下调iNOS的活性，表明脑血灵颗粒对脑出血后的炎症损伤具有保护作用.
 
　　脑血灵颗粒剂对急性脑出血的抗炎机制与其独特的方剂组合有密切关系，其主要的抗炎药机制主要有以下几个方面：① 方中主药水蛭含水蛭素目前最强的凝血酶抑制剂［7］，而凝血酶是一种重要的前炎症因子，可以上调炎性细胞因子的表达水平如TNFα, IL1β, P选择素,E选择素等，从而介导炎症反应的发生. 因此脑血灵颗粒剂对与炎症最直接相关的凝血酶阶段具有显著的抑制作用. ② 方中主药“黄连、黄芩”等清热解毒类药可在mRNA及蛋白质水平抑制脑出血后对iNOS, TNFα和IL1β的合成和分泌，阻断细胞因子之间的恶性循环及其炎症级联放大机制，从而起到神经元保护作用. 本研究表明中药复方脑血灵颗粒治疗急性脑出血的重要作用机制之一，可能通过拮抗凝血酶，降低iNOS, TNFα和IL1β的上增性表达，在脑出血的继发性损伤中发挥抗炎症效应，减轻其诱发的神经毒性作用，最终达到保护神经细胞的目的，从而为脑血灵颗粒剂的临床应用提供药理学实验依据.

　　【文献】

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　　［3］ Botin H, LeFeuvre RA, Horai R, et al. Role of IL1alpha and IL1beta in ischemic brain damage［J］. Neuro Sci, 2001,21(15):5528-5534.

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　　［5］del Zoppo G, Ginis I, Hallenbeck JM, et al. Inflammation and stroke: putative role for cytokines, adhesion molecules and iNOS in brain response to ischemia ［J］. Brain Pathol, 2000,10(1):95-112.

　　［6］ del Bigio MR, Yan HJ, Buist R,et al.Experimental intracerebral hemorrhage in rats. Magnetic resonance imaging and histopathological correlates［J］. Stroke, 1996, 27(12): 2312-2319.

　　［7］ 吕明远. 近年来中药水蛭的研究概况［J］. 天津药学,2005,17(3):62-63.