紫杉醇诱导人子宫内膜癌细胞增殖凋亡的实验研究

           作者：甘泉，辛晓燕，刘玉，王德堂，郭会玲

【关键词】  紫杉醇；子宫内膜肿瘤；,子宫内膜癌细胞珠；,增殖；,凋亡；,caspase

　　Experimental study on human endometrial adenocarcinoma cell apoptosis induced by taxol

　　【Abstract】 AIM： To investigate the inhibition of proliferation and induction of apoptosis  in vitro cultured human endometrial adenocarcinoma cell （HEC1B） by taxol. METHODS： Human  endometrial adenocarcinoma HEC1B cells were cultured in vitro and treated with 2， 4， 8， 16， 20 nmol／L taxol for 48 h. Cell apoptosis was observed by nuclear staining and fluorescence microscopy and intracellular calcium fluorescence pixel values of live cells were detected by laser scanning confocal microscope. RESULTS: Through the blockage of caspase pathway with caspase3 inhibitor， taxol induced apoptosis was suppressed in endometrial carcinoma cells. CONCLUSION: Taxol inhibits the proliferation and induces the apoptosis of human endometrial adenocarcinoma HEC1B cells.

　　【Keywords】 taxol; endometrial neoplasms; HEC1B; proliferation; apoptosis; caspase3

　　【摘要】 目的：探讨紫杉醇对体外培养的人子宫内膜癌细胞（HEC1B）凋亡的诱导作用. 方法：体外培养的HEC1B细胞，用终浓度2， 4， 8，16，20 nmol/L的紫杉醇作用48 h后，荧光染色检测细胞凋亡的发生情况、caspase3及其抑制剂紫杉醇在诱导细胞凋亡中的作用. 结果：共聚焦检测活细胞内钙离子的动态变化与Caspase3半胱氨酸蛋白酶中细胞凋亡，使HEC1B细胞在活化过程中起了关键性的因素. 结论：HEC1B对紫杉醇具有药物敏感性，紫杉醇对HEC1B细胞的杀伤作用，是通过诱导细胞凋亡途径实现的.

　　【关键词】 紫杉醇；子宫内膜肿瘤； 子宫内膜癌细胞珠； 增殖； 凋亡； caspase3

　　0引言

　　子宫内膜癌（endometrial cancer，EC）是女性生殖器官三大恶性肿瘤之一，占女性生殖系统恶性肿瘤的20%~30%［1］. 在方面一直沿用传统的手术、手术加放疗或激素治疗. 因此，疗效及治愈率无提高. 化疗在恶性肿瘤的治疗中具有重要作用，在晚期肿瘤的治疗中尤为重要. 近年来，EC的发病率有明显上升趋势［2］，为了进一步提高子宫内膜的疗效，探索紫杉醇对子宫内膜癌在临床上的应用提供理论及实验依据.

　　紫杉醇(taxol，paclitaxe1)是一种新的抗微管药物. 紫杉醇作为抗癌药，对前列腺癌、乳腺癌等治疗已有广泛的应用. 新辅助化疗对子宫内膜癌的疗效不断肯定［1］，肿瘤的发生及是细胞无限制过度增殖的过程，化疗对肿瘤的作用应包括杀伤肿瘤和抑制肿瘤细胞分裂，增殖及促进调亡两方面. 本文探讨了新辅助化疗对HEC1B细胞调亡及增殖的影响，现报道如下.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　1.1.1细胞株从美国American Type Culture Collection (ATCC)引进的HEC1B细胞株购自中科院上海生命研究院细胞所. 培养基：EMEM培养基（美国Gibco公司）；血清：胎牛血清（杭州四季清）. 细胞培养：按照ATCC提供的培养传代方法［6］培养于含100 mL/L胎牛血清、1.0 mmol/L丙酮酸钠，1.0 mmol/L非必需氨基酸和1.5 g/L碳酸氢钠的EMEM培养液中，在37℃，50 mL/L CO2培养箱中培养.

　　1.1.2药物与试剂抗体①Taxol：北京四环医药科技股份有限公司产品; ②caspase3多克隆抗体（Santa Cruz Biotec，CA  USA）.

　　1.1.3细胞培养用品EMEM培养基：美国Gibco公司产品. 用时按说明用三蒸水配制，并加入100 mL/L非必需氨基酸和1.5 g/L碳酸氢钠的EMEM培养液用0.22 μm滤器除菌，4℃冰箱保存.  胎牛血清：杭州四季青生物工程材料研究所生产.  胰蛋白酶：美国Gibco公司产品. 用无血清培养液配成2.5 g/L浓度，0.22 μm滤器除菌，4℃冰箱保存. 40 cm培养皿：中间有9 mm小孔. Costar公司产品. (以上试剂均购于博微生物科技有限公司).

　　1.2方法

　1.2.1子宫内膜癌细胞株HEC1BGIBCO EMEM培养液中(含100 mL/L胎牛血清、100 μm/mL青霉素，100 μm/mL链霉素，丙酮酸钠1.0 mmol/L,非必需1.0 mmol/L氨基酸和1.2 g/L碳酸氢钠, pH 7.0~7.2值)，于37℃, 50 mL/L CO2培养箱中培养，每48 h换液一次，细胞呈单层贴壁生长，2.5 g/L胰蛋白酶消化传代. 选用对数生长期细胞进行实验［5-6］.

　　1.2.2细胞增殖活力检测将贴壁细胞消化传代后计数，调整细胞浓度为1×104/mL，接种于24孔培养板中，37℃，50 mL/L CO2及饱和湿度条件下培养. 实验时分为2，4，8，16，20 nmol/L 5个药物浓度组及对照组，每组5个孔，细胞接种后24 h加药，分别于加药后12，24，48，72 h测定各孔的吸光度值（A值）. 测定前弃去培养孔上清后，每孔加500 μL新配制的5 g/L MTT，37℃继续孵育4 h，弃上清加150 μL DMSO溶解，混匀后用DG3022型酶标仪，在490 nm波长处测定细胞的光吸收值，并按肿瘤细胞抑制率(%)=(1-实验孔A值/对照孔A值)×100［5,7］.

　　1.2.3采用细胞计数法取细胞生长期的细胞用2.5 g/L的胰酶消化制成单细胞悬液，调整细胞密度悬浮于新鲜含100 mL/L胎牛血清EMEM培养液接种细胞1×103个细胞，40 cm点孔直径为9 mm的6个培养皿里. 观察细胞贴壁后，每个培养皿紫杉醇的浓度分别为2, 4, 8, 16, 20 nmol/L，作用48 h后加入caspase3抗体(按照Santa Cruz说明书1∶100~1∶500)，观察细胞Hoechet染色，在激光共聚焦扫描(仪器的型号  MPC1024,美国BTORAD公司)，分析软件（TimeCouRSE Lasersharp）检测子宫内膜癌细胞凋亡和钙离子的浓度变化［5,8-9］.