肺表面活性物质对哮喘小鼠模型树突细胞功能的调节机制

【关键词】  表面

    Role of pulmonary surfactant in regulating dendritic cell function of murine asthma models

        【Abstract】 AIM: To explore the mechanisms of exogenous pulmonary surfactant（PS） in regulating the immunity of murine asthma models and its effect on dendritic cell (DC) function of the spleen of the asthma models. METHODS:  Murine asthma models were established with ovalbumin (OVA) sensitization and challenge and the models were confirmed by histological analysis of lung tissues. FACS was used to measure the expression of CD80 on DC derived from the spleen of OVAsensitized and challenged mice. PS was inhaled after OVA challenge by 20 g/L for 2, 5, 10, 15 and 20 min. IL12 in DC culture medium was tested at 2, 4, 6, 12 and 24 h and data were analyzed with SPSS 10.0 software. RESULTS:  Histological analysis results of lung tissues were consistent with the characteristics of murine asthma model. The expression rate of CD80 on spleenderived DC in asthma group significantly increased compared with that in PS group (P<0.01) and CD80 expression rate was the lowest when PS was inhaled for 2 min. IL12 in asthma group decreased compared with that in PS group (P<0.01). PS group kept IL12 at a high level for a long time while IL12 expression level was low and lasted for a short time in asthma group. CONCLUSION:  Abnormal DC function is existent in murine asthma models and exogenous surfactant can regulate the DC function by suppressing the expression of CD80 on DC and increasing the level of IL12 secreted by DC, which can improve the respiratory function when the asthma is challenged.

    【Keywords】 pulmonary surfactant； dendritic cell； costimulatory molecules；IL12； asthma

    【摘要】 目的： 研究外源性肺表面活性物质对小鼠哮喘模型的免疫调节作用及其对树突细胞（DC）功能的影响. 方法：BALB/c小鼠50只，分为3组：哮喘组15只［采用卵蛋白（OVA）致敏和激发］、对照组15只（以生理盐水代替OVA致敏和激发）、组20只［每次OVA激发后10 min以肺表面活性物质（PS） 20 g/L雾化吸入，时间为2,5,10,15和20 min］. 用HE染色方法评定哮喘模型. 分离培养脾脏DC，用流式细胞仪（FACS）检测DC表面共刺激分子CD80的表达变化. 取DC培养液3 mL，加入OVA，调整OVA浓度至10 mg/L. 分别在2，4，6，12，24 h取DC培养液，1300 r/min离心5 min，取上清液，ELISA法检测IL12 P70. 结果： 哮喘组小鼠的肺组织表现为嗜酸细胞及淋巴细胞浸润为主的炎症变化，治疗组和对照组无此变化. 哮喘组DC阳性表达率明显高于治疗组(P<0.01)；吸入PS对DC表面共刺激分子的抑制作用在2 min时最强. 哮喘组DC上清液IL12低于治疗组(P<0.01)；治疗组DC上清液IL12可以在高水平维持较长时间，而哮喘组的DC上清液IL12含量降低，且维持时间较短. 结论：小鼠哮喘模型中存在明显的DC功能缺陷；外源性吸入PS，能明显改善DC功能，从而保护哮喘发作时小鼠的肺功能.

    【关键词】 肺表面活性剂；树突细胞；共刺激分子；白细胞介素12；哮喘

    0引言

    支气管哮喘(简称哮喘)是一种慢性气道炎症,其中CD4+ T淋巴细胞异常活化起关键作用. 肺表面活性物质(pulmonary surfactant，PS)是由肺泡Ⅱ型细胞合成、分泌的脂蛋白,具有降低表面张力、维持肺泡稳定性作用. 研究表明,哮喘发作时气道中的PS存在量和功能的异常［1］,从而加重气道阻塞,而外源性补充PS可明显减轻症状，改善肺功能. 体外研究发现, PS的脂质成分具有抗炎及免疫调节作用［2］. 树突状细胞(dendritic cell，DC)是体内强有力的专职抗原提呈细胞. DC通过MHC和共刺激分子与Th0相互作用，提呈抗原给T淋巴细胞(TC)，并通过产生细胞因子(如IL12)诱导Th1或Th2型免疫. IL12可诱导强烈的Th1应答反应，其在维持Th1/Th2平衡方面起关键作用［3］ . 我们从外源性吸入肺表面活性物质调节DC功能方面探讨其治疗支气管哮喘的免疫学机制.

    1材料和方法

    1.1材料4～6 wk龄BALB/c小鼠(第四军医大学动物研究中心) 50只，体质量16~20 g，雌雄不拘. 402型超声雾化器； 卵蛋白(OVA)（Grade 2，Sigma公司）. IL12 P70 ELISA试剂盒（博士德公司）；PE大鼠IgG和PECD80 mAb（Southern Biotech公司）.

    1.2方法

    1.2.1小鼠哮喘模型的建立将小鼠分为3组.  ① A组：健康对照组15只，室温下常规饲养；② B组：哮喘组15只，小鼠分别于第1，3，5，7，9，11，13日腹腔注射OVA 10 μg；第45日时，将每只小鼠单独置于5 L密闭容器中，以10 g/L OVA进行雾化吸入激发5 min，持续6 d；③C组：治疗组20只，取15只小鼠在每次激发哮喘前吸入肺表面活性物质(PS) 2 min，其他同B组. 其余5只小鼠在每次激发前吸入PS，分别吸入1，2，5，10和20 min. B，C组小鼠最后1次激发24 h后同A组小鼠一起用40 g/L戊巴比妥腹腔麻醉，打开胸腔，观察肺脏；将5号输液器针头刺入右心室，同时将右心房剪一缺口，9 g/L盐水和40 g/L多聚甲醛液依次进行内灌注，剪取部分肺组织，切片，HE染色.

    1.2.2脾脏DC的分离、培养参照［4］，取B，C组小鼠各10只，在最后一次激发后24 h处死小鼠，无菌打开腹腔，取出脾脏放入冷PBS 50 mL中，将其捻碎，过滤100目无菌钢网，收集脾细胞悬液；1300 r/min洗涤5 min×3次；用完全培养基20 mL重悬细胞于100 mL培养瓶中，37℃，5 mL/L CO2孵育2 h；用完全培养基20 mL剧烈洗摇培养瓶，吸弃悬液，反复共4次；37℃, 50 mL/L CO2孵育过夜；收集悬浮细胞备用.

    1.2.3DC表面分子CD80的检测将1.2.2中B，C组小鼠新鲜制备的DC 1×106个加入1.5 mL Ep管中，加入PBS，2000 r/min洗涤5 min×2次；加入PECD80 mAb 0.2 pg，空白对照管加入PE大鼠IgG溶液0.2 pg；4℃放置30 min；加入PBS，2000 r/min洗涤5 min×3次；吹打混匀细胞，进行FACS分析.

    1.2.4吸入不同剂量PS对DC CD80阳性表达率的影响取C组5只小鼠，分别在激发前吸入PS 1，2，5，10和20 min. 吸入浓度皆为20 g/L. 然后重复上述步骤，最后得出吸入PS不同剂量与DC CD80阳性表达率的关系曲线.

    1.2.5DC上清液IL12的检测取1.2.2中B，C组树突细胞培养液3 mL，加入OVA，调整OVA浓度至0.01 g/L. 分别在2，4，6，12，24 h取培养液，1300 r/min离心5 min，取上清液，ELISA法检测IL12 P70.统计学处理：采用SPSS 10.0软件进行统计分析，样本x±s，两样本均数比较采用t检验. P<0.05差异有显著意义.

    2结果

    2.1肺切片HE染色B组小鼠肺切片HE染色可见支气管上皮细胞肿胀、脱落,管壁增厚,管腔变窄,管壁内及管周有大量炎性细胞浸润,以嗜酸粒细胞和淋巴细胞为主；C组小鼠的肺组织可见支气管上皮的炎症反应较B组轻，支气管壁及管腔内嗜酸粒细胞和淋巴细胞也大为减少；A组小鼠的肺组织则无上述改变（图1）.

    图1小鼠肺组织HE染色HE ×200

    2.2DC表面共刺激分子CD80表达率脾脏提取的DC在2～4 h已完全贴壁，倒置显微镜下观察显示，大部分细胞表现为球形突起，少数细胞有梭状分支. 经流式细胞仪检测，B组DC表面共刺激分子CD80表达率为（85.37±2.37）%，C组（78.28±3.71）%，二者相差显著（P<0.01）.

    2.3不同剂量吸入PS对DC CD80阳性表达率的影响吸入PS 1，2，5，10，20 min后， DC CD80阳性表达率分别为80.21%，72.31%，73.12%，75.12%和78.12%. PS抑制小鼠哮喘模型DC CD80阳性表达率与PS的吸入剂量有关，在20 g/L吸入浓度下，吸入2 min效果最佳.

    2.4DC上清液中IL12 P70C组DC上清液 IL12可以在高水平维持较长时间，而B组的DC上清液IL12含量降低，且维持时间较短（图2）.

    图2树突细胞培养基上清液中IL12的含量

    3讨论

    PS异常可能是哮喘气道炎症加重的重要原因. 哮喘的一些传统药物如类固醇、肾上腺素受体激动剂等都具有促进PS合成和分泌的作用，它们的疗效可能部分与PS有关. 我们的研究发现，经预防性吸入PS，可明显降低哮喘小鼠的气道炎症，减轻气道水肿及支气管痉挛. 这与国外的研究报道一致［5］.DC为CD4+ T细胞活化所必需. DC广泛分布于皮肤、胃肠道、气道等外来物质入侵的第一线位置，形成广泛的细胞，并在该处固有细胞之间伸出触角以增加识别抗原的机会，且不成熟DC表达各种受体，如C型凝聚素受体、免疫球蛋白受体和补体受体，介导胞饮作用或吞噬作用以摄取抗原［6］. DC内的特异性MHCⅡ分子对抗原进行加工和处理而形成抗原肽MHCⅡ复合物. 且DC将从外周组织中所摄取抗原运送至输出淋巴结的T细胞区，尽管其他类型的细胞，如巨噬细胞也能将抗原运送至输出淋巴结，但将抗原直接运送至T细胞区是DC特有的功能. CD4+ T细胞活化需两个刺激信号［7］. 在输出淋巴结内，DC表面的抗原肽MHCⅡ复合物与T细胞表面的TCR特异性结合，同时DC表达共刺激分子CD80和CD86，与T细胞上的CD28结合形成CD80/CD86CD28共刺激通路. 故DC能为CD4+ T细胞活化提供所需的特异性抗原识别信号和共刺激信号两个刺激信号，对哮喘CD4+ T细胞活化是必不可少的. 我们的研究发现，外源性吸入PS，可以抑制哮喘小鼠DC CD80的阳性表达率，进而抑制了哮喘过程中CD4+ T细胞的活化.IL12是Th1分化细胞因子，DC分泌IL12诱导强烈的Th1分化，并产生Th1型细胞因子IFNγ，后者反过来增强DC表达IL12，从而形成正反馈，增强Th1应答反应. 由于哮喘患者存在DC功能异常，合成IL12减少，从而引起TC释放IL4过量和IFNγ不足［8］. 本文研究表明，外源性吸入PS可增强DC分泌IL12的功能，治疗组DC培养基中检测的IL12明显高于哮喘组，并且可以使DC高分泌IL12的功能维持较长时间水平，而哮喘组的IL12水平则明显减低. PS中磷脂成分的主要作用为降低肺泡表面张力，但也发现具有部分肺部免疫调节作用. 我们先前的实验验证了吸入PS可减轻哮喘发作，并观察到气道局部EGF及EGF mRNA表达相应降低. 故我们认为，PS可能通过降低支气管及肺组织EGF的表达，减轻了哮喘发作及相关病改变［9］. 目前替代治疗所用PS主要成分为磷脂，通过对PS替代产品功能的分析，可以认为磷脂对肺部免疫的调节以抑制作用为主. 在研究中我们发现，外源性吸入PS，能明显的抑制小鼠哮喘模型DC表面共刺激分子CD80的表达，进而抑制了DC的迁移与成熟. 在哮喘组DC上清液IL12低于治疗组. 治疗组树突细胞上清液 IL12可以维持较长时间，而哮喘组的树突细胞上清液 IL12含量降低，且维持时间较短.以上结果表明，小鼠哮喘模型中存在明显的DC功能缺陷. 外源性吸入PS，能明显改善DC功能，从而保护了哮喘发作时小鼠的肺功能，这为外源性吸入PS治疗哮喘提供了依据.

    【】

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