芪丹通脉片对大鼠海马局部缺血及HSP70蛋白表达的影响

                            作者：王冰，王宗仁，王洪典，江山，李锋，马静，行利

【关键词】  芪丹

    Effect of QDTMT on expression of HSP70 in hippocampus of rats with focal cerebral ischemia

     【Abstract】 AIM: To study the effect of Qidantongmai Tablet (QDTMT) on rats with focal hippocampal infarction. METHODS:  Seventytwo male SD rats were randomly divided into 6 groups (n=12): control, shamoperated, ischemia, QDTMT of high dosage (QDTMTH), QDTMT of moderate  dosage （QDTMTM) and QDTMT of low dosage (QDTMTL). The rat models were produced by photochemical methods and the expression of HSP70 was measured by immunohistochemistry after the pathological analysis. RESULTS:  The pathological changes decreased in rats treated by QDTMT compared with those in control group. HSP70 positive cells in QDTMTtreated groups were more than those in control group: ischemia group (23±3）, QDTMTH (89±8）, QDTMTM (78±6), QDTMTL（46±6） (P<0.01). CONCLUSION:  The neuroprotective effect of QDTMT may be related with its upregulation of HSP70 in the rat brain after focal cerebral ischemia.

    【Keywords】 Qidantongmai Tablet；brain infarction; hippocampus

    【摘要】 目的: 探讨芪丹通脉片(QDTMT)对大鼠海马局部梗死的影响和机制. 方法：雄性SD大鼠72只，随机分为6组（n=12），即空白对照组、假手术组、缺血组、ＱＤＴＭＴ高剂量组（ＱＤＴＭＴH），ＱＤＴＭＴ中剂量组（ＱＤＴＭＴM），ＱＤＴＭＴ低剂量组（ＱＤＴＭＴL）. 采用光化学法诱导大鼠单侧海马梗死模型, 对缺血脑组织进行病理形态学分析及HSP70免疫组化. 结果：QDTMT各给药组缺血灶内HSP70表达明显高于缺血组：缺血组23±3，ＱＤＴＭＴH组89±8，ＱＤＴＭＴM组78±6，ＱＤＴＭＴL组46±6（P<0.05）. 结论：QDTMT能减轻大鼠海马局部脑梗死损伤程度，可能与上调HSP70表达有关.

    【关键词】 芪丹通脉片; 脑梗塞；海马

    0引言

    脑缺血后HSP70在鼠脑中的表达具有神经保护作用，药物的干预等因素能影响HSP70在缺血性脑损伤细胞中的表达.  我们通过光化学法诱导的海马局部梗死模型，观察芪丹通脉片对缺血大鼠脑组织病理形态学及HSP70表达的影响，并对其脑保护机制进行了探讨.

    1材料和方法

    1.1材料SD雄性大鼠72只,体质量(200±20) g（第四军医大学实验动物研究中心提供）. 芪丹通脉片（Qidantongmai Tablet，ＱＤＴＭＴ）提取浸膏干粉（西京提供），加生理盐水配制成混悬液. 虎红（四氯四碘荧光素钠粉剂,RB,北京化工厂，批号：810627）,密封避光保存，使用前用生理盐水稀释为25 g/L. 自制冷光源(西京医院理疗科和西安飞秒光电集团联合研制)，光源为一充气氙灯，输出功率：MIN 0.008 W/cm2, MAX 0.37 W/cm2，输出波长490～550 nm，波峰530 nm, 输出端连一直径0.6 mm的石英光纤.

    1.2方法

    1.2.1海马局灶性缺血模型制备动物随机分为6组,每组12只，分别是空白对照组、假手术组、缺血组、 ＱＤＴＭＴH组(3.24 ｍｇ/ｋｇ)， ＱＤＴＭＴM组(1.08 ｍｇ/ｋｇ), ＱＤＴＭＴL组(0.36 ｍｇ/ｋｇ). 大鼠用10 g/L戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔注射麻醉后，将其俯卧于脑立体定位仪上，沿头颅正中切开头皮暴露颅骨，在前囟后4.8 mm、中线向左旁开3.6 mm处，用牙科钻轻轻钻一个直径约1 mm的骨窗，光纤管尾端至皮层下3.1 mm（海马区）. 于尾静脉注射25 ｇ/L虎红（70 mg/kg）后，立即通过光纤管照射30 min. 光照强度：0.37 W/cm2. 术后缝合头皮，正常喂养. 假手术组尾静脉注射等体积生理盐水后光纤插入照射. ＱＤＴＭＴ各剂量组于术后当日以10 mL/kg灌胃ＱＤＴＭＴ溶液1 wk，1次/d. 缺血组及假手术组用等体积生理盐水替代灌胃，余同中药组.

    1.2.2取脑固定术后第8日，将各组大鼠麻醉后开胸暴露心脏，经主动脉，先用生理盐水100 mL迅速冲洗血液，再用40 g/L多聚甲醛400 mL灌注固定2 h,取脑在4℃下进行后固定.

    1.2.3观察病理改变每组取6只鼠脑，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，经缺血处连续切片，片厚5 μm,每隔50 μm取1片，HE染色，光镜下观察组织病改变. 每只鼠脑取经缺血灶中心5张切片，光镜下（10×10）计数每张切片缺血灶内缺血神经细胞数. 经海马部位取材3 ｍｍ3大小组织块，30 mL/L戊二醛前固定，10 g/L锇酸后固定，0.1 mol/L PBS漂洗、丙酮梯度脱水, 丙酮∶包埋剂(1∶1)浸透,环氧树脂包埋及修块,超薄切片后, ＪＥＭ1200ＥＸ透射电镜下观察.

    1.2.4免疫组化分析每组取6只鼠脑，200 g/L蔗糖脱水至沉底，冰冻切片机经梗死部位进行30 μm厚连续冠状切片. 取缺血灶相同层面脑片做HSP70免疫组化ABC法染色. 主要步骤如下:切片经0.01 mol/L KPBS漂洗3×10 min后入含30 mg/L Triton X100的KPBS 30 min;经1∶2000小鼠抗 HSP70血清(Sigma)室温摇床孵育24 h;再经生物素化的抗鼠IgG(1∶500,Santa)抗血清室温2 h;ABC液(1∶500, Santa)室温2 h;DAB葡萄糖氧化酶法呈色,常规贴片、干燥、脱水透明、封片.每步骤后均用0.01 mol/L KPBS(pH 7.4)充分洗涤.对照脑片以KPBS替代一抗.取每只鼠脑经缺血灶的5张脑片，在光镜下（10×10）计数阳性细胞数. 出每组6只大鼠的免疫染色阳性细胞数.统计学分析: 数据以x±s表示,用SPSS统计软件进行方差分析，并用SNK方法进行组间两两比较.

    2结果

    2.1病理改变和缺血神经细胞数比较光镜下可见，片状缺血灶区神经元肿胀、细胞核固缩深染，胞质嗜伊红性增强呈粉红色. 缺血侧组织空泡化. 在梗塞核心区部分神经元消失,残存的神经元严重变性,呈不可逆性 . ＱＤＴＭＴ各组缺血神经细胞较缺血组少，假手术组几乎无缺血损伤. 电镜结果可见，正常对照组神经元细胞形态完整,可见丰富的粗面内质网、游离核糖体和线粒体;线粒体嵴清晰,排列规则;核膜清晰,核内染色质以常染色质为主,核仁明显，微管、神经丝排列整齐;突触结构正常;毛细血管内壁光滑，内皮细胞结构完整，清晰. 模型组坏死中心区结构崩解严重，胞核染色质崩解，核溶解，仅见少量残存细胞器，细胞轮廓消失；在坏死周边部位，神经细胞核空泡化，核内异染色质增多，凝聚呈块状，边集明显；线粒体空泡化明显，嵴消失；微管、神经丝排列紊乱；毛细血管轮廓存在，内皮细胞消失，呈凝固性坏死改变(图1A). QDTMT各组神经元密度增高，核膜清晰,核内异染色质稍增多,核周间隙较狭窄；胞质内细胞器较明显,但内质网和线粒体均有水肿样改变,线粒体电子密度低,嵴减少,粗面内质网脱颗粒并扩张呈不规则泡状,高尔基体扩张，存在髓鞘样结构和少量紫褐素颗粒，毛细血管管周轻度水肿（图1B）.A：缺血组； B：给药组.

    图1芪丹通脉片对大鼠海马局部缺血病理结构的影响TEM ×12 000

    2.2HSP70免疫组化分析缺血组阳性细胞表达最少，中药组阳性细胞表达数增多，各剂量组间比较有差别，假手术组未见表达(表1，图2）.

    表1各组大鼠缺血神经细胞及HSP70免疫阳性细胞数比较（略）

    图2芪丹通脉片对大鼠海马局部缺血HSP70表达的影响×25

    3讨论

    缺血性脑血管病属祖国医学"中风"范畴,正气虚弱，肝肾亏虚，痰瘀阻滞为其主导病机. 中医主要以益气活血、养血通窍等方法辨证论治. 临床上活血化瘀复方制剂被广泛用于治疗缺血性脑血管疾病. 中医学认为，血瘀证涵盖血液循环障碍、血栓形成、血小板活化黏附聚集、组织增生变性、炎症、动脉粥样硬化及生物活性因子调控异常等诸多病理改变. 活血化瘀的作用不仅表现为改善血液的流动性和血液黏度，降低血小板活化黏附聚集，抑制平滑肌细胞增生及其某些方面相关基因、蛋白的调控表达等，还包括影响血液循环的神经、体液调节及免疫功能等.QDTMT是在气血相关理论指导下制成的纯中药复方制剂，主要由黄芪、丹参、当归、红花、桂枝组成.其中,黄芪与桂枝益气通阳，丹参、红花活血化瘀，当归养血活血. 现代药理研究证明，黄芪活性成分黄芪 皂甙能改善细胞能量代谢，抑制血小板聚集，提高细胞内超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）活性. 丹参所含丹参素具有抗缺血、抗自由基、抑制细胞内游离钙离子浓度升高等作用，当归和红花可改善微循环，桂枝有促进纤溶等作用.  该药在既往实验研究中被证实，可以改善血流变浓、黏、凝、聚状态，保护缺氧状态下细胞线粒体结构,减轻氧自由基对细胞膜的损伤，具有抗血栓形成，保护血管内皮细胞等作用［1-2］.神经元调亡是脑缺血后迟发性神经元损伤的重要机制之一. HSP70蛋白表达与缺血引起的海马区迟发性神经元损害关系密切. HSP70合成增加可防止蛋白质聚集. 它一方面阻止诱导调亡的因素起作用，另一方面保护染色体，防止参与调亡的蛋白酶和核酸攻击，阻止细胞开启自杀途径，减轻了细胞调亡.本实验表明，ＱＤＴＭＴ对光化学法大鼠脑局部缺血损伤有保护作用. 大鼠局部缺血造模后，ＱＤＴＭＴ各给药组病理改变均较缺血对照组轻，且上调了HSP70蛋白表达. 轻度脑缺血损伤即可诱导HSP70表达，中度缺血可诱导转录，但不翻译，重度缺血时它只在梗死边缘区表达［3-4］. 本实验也观察到，中药治疗各组在缺血区和皮层等远隔区域有大量HSP70阳性细胞表达，而缺血组仅在坏死周边区域有少量表达. ＱＤＴＭＴ可能通过改善脑缺血局部微循环，促进HSP70蛋白表达，增强脑组织的修复能力.

    【】

［1］ 王宗仁,马静,行利，等.芪丹通脉片对大鼠心肌线粒体损伤的保护作用［J］.第四军医大学学报，2003，24（5）：400-402.
［2］ 魏立强,王宗仁,王琳，等. 芪丹通脉片对大鼠血管内皮细胞损伤的保护作用［J］. 第四军医大学学报，2005，26（4）：321-324.
［3］ Giffard RG, Yenari MA.Many mechanisms for hsp70 protection from cerebral ischemia ［J］. Neurosurgery，2003，53(1):186-191.
［4］ Lee SH, Kwon HM, Kim YJ, et al.  Effects of hsp70.1 gene knockout on the mitochondrial apoptotic pathway after focal cerebral ischemia［J］. Stroke， 2004,35(9):2195-2199.