人羧肽酶A1活性中心的毕赤酵母可溶表达

                             作者：易静，郝晓柯，苏明权，岳乔红，刘家云，张瑞，雷迎峰

【关键词】  人羧肽酶

        【Abstract】 AIM: To express the human carboxypeptidase A1 (CPA1) active center protein in soluble form in pichia yeast. METHODS:  Human CPA1 active center gene was amplified from pGEXCPA1 recombinant plasmid and subcloned into pPIC9K yeast expression vector. Recombinant vector pPIC9KCPA1 active center was transformed into pichia SMD1168 by electroporation. Positive recombinant yeast strains were screened through nutrition defect and G418 resistance. The integrated multicopy recombinant yeast strains were induced for expression. RESULTS:  The yeast recombinant expression vector pPIC9KCPA1 active center was constructed and recombinant yeast strains which integrated over 16 recombinant vector copies were obtained. The human CPA1 active center protein was expressed in soluble form in pichia yeast after screened with G418. CONCLUSION:  Human CPA1 active center protein has been expressed successfully in pichia yeast, which will be useful for further research on ADEPT of prospate.

    【Keywords】 carboxypeptidase A；active center；pichia; gene expression

    【摘要】 目的：应用毕赤酵母表达系统表达人羧肽酶A1 (carboxypeptidase A1，CPA1）活性中心蛋白. 方法：从pGEXCPA1重组质粒中扩增出CPA1活性中心基因，亚克隆入酵母表达载体pPIC9K，酵母重组表达载体pPIC9KCPA1active center电转化入毕赤酵母SMD1168，并进行营养缺陷筛选和G418抗性筛选，对高拷贝整合的重组酵母表达菌株诱导表达. 结果：构建得到酵母融合重组表达载体pPIC9KCPA1active center，经G418浓度梯度筛选得到串联整合16个重组表达载体的重组酵母表达菌株，诱导表达后得到CPA1活性中心蛋白. 结论：在毕赤酵母中成功表达了CPA1活性中心，为进一步研究CPA1活性中心在抗体导向酶-前体药物疗法中的应用打下了基础.

    【关键词】 羧肽酶类A；活性中心；毕赤酵母；基因表达

    0引言

    羧肽酶A（carboxypeptidase A,CPA）是一类水解蛋白和多肽底物C端芳香族或脂肪族氨基酸残基的消化酶，因其底物的首位字母“A”而得名CPA［1］ . CPA除用于传统的蛋白质或多肽修饰及食品加工外，还能用于疾病的，如在抗体导向酶-前体药物疗法(antibodydirected enzyme prodrug therapy，ADEPT)中，CPA即被用作识别前药的专一活化酶［2］，它特异性切割前药的特定残基，使其在肿瘤组织中活化，增加了药物的特异性，减少了其对正常组织的毒副作用. 本研究组应用人CPA1对前列腺癌ADEPT疗法进行了多年研究，已克隆并在大肠杆菌中表达了CPA1活性中心基因［3］. 由于原核表达的局限性影响了CPA1的生物活性. 为了得到结构和生物学活性更接近人CPA1的蛋白，我们拟采用Pichia酵母真核表达系统(SMD1168宿主细胞)分泌表达人CPA1活性中心蛋白，为人CPA1活性中心蛋白在前列腺癌ADEPT疗法中的应用奠定基础.

    1材料和方法

    1．1材料毕赤酵母菌SMDI1168(his4，pep4)由第四军医大学微生物学教研室提供；大肠杆菌DH5α和毕赤酵母表达质粒pPIC9K由第四军医大学生物化学与分子生物学教研室提供；pGEXCPA1active center重组质粒由第四军医大学西京检验科构建；限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、T4DNA连接酶均为TaKaRa公司产品；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒为Promega公司产品；其他试剂均为分析纯，电穿孔仪和蛋白电泳仪购自BioRad公司.

    1．2方法

    1．2．1引物设计及基因扩增根据［4］报道的CPA1活性中心基因序列设计引物，由上海生工生物工程公司合成，其中正向引物P1的5′端引入EcoR I酶切位点，反向引物P2的5′端引入Not I酶切位点. P1: 5′ GGAATTCATGATCGACACGGGCATCCATTC 3′； P2：5′ AGCGGCCGCTCAAGTGTCCCGGAGCTCGAA 3′. 用上述引物进行PCR扩增，反应体系组成：模板0.5 μL，引物各12.5 pmol，2.5 mmol/L  dNTP 2 μL， 10×PCR缓冲液2.5 μL（含MgCl2），Taq DNA聚合酶0.5 U，再用去离子水补至25 μL. 循环参数为94℃ 5 min后，94℃变性0.5 min，55℃退火0.5 min，72℃延伸2 min，经过30个循环，最后72℃ 延伸7 min．PCR产物经15 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定结果.

    1．2．2重组表达载体的构建及鉴定纯化PCR产物，用EcoR I和Not I进行双酶切，所获片段亚克隆到经同样双酶切的pPIC9K载体中，得到的重组表达质粒转化DH5α感受态细胞，经氨苄青霉素筛选，阳性克隆送上海生工生物工程公司测序，鉴定所插入的片段序列及构建载体的读码框架. 经序列分析后，所得正确的重组表达质粒命名为pPIC9KCPA1active center.

    1．2．3转染毕赤酵母菌约10 μg的pPIC9KCPA1active center的质粒DNA用BglII酶切线性化，然后用电穿孔法转入毕赤酵母感受态细胞并涂布在缺组氨酸的MD平板(13.4 g/L酵母含氮碱基；20 g/L葡萄糖；4×10-5 g/L生物素；15 g/L琼脂)上. pPIC9K质粒含有卡那霉素抗性基因，其转染的宿主菌能抗氨基糖甙类抗生素(G418). 采用含不同浓度(0．5～4.0 g/L)G418的YEPD平板(10 g/L酵母提取物；2 g/L蛋白胨；2 g/L葡萄糖；20 g/L琼脂)来筛选高拷贝转化子.

    1．2．4PCR检测CPA1活性中心基因与毕赤酵母染色体基因组的整合按照Invitrogen公司提供的方法，提取能抗4.0 g/L G418的毕赤酵母菌总DNA，用PCR法检测CPA1活性中心基因与毕赤酵母染色体基因组的整合，在相同的条件下,用pPIC9KCPA1active center质粒DNA，pPIC9K质粒DNA和pPIC9K空质粒转化的毕赤酵母菌总DNA作对照.

    1．2．5人CPA1活性中心基因的表达和鉴定挑取抗4.0 g/L G418的阳性克隆接种于100 mL BMGY（13．4 g/L YNB，4×10-5 g/L生物素，100 mL/L磷酸缓冲液，10 mL/L甘油）培养液中. 30℃，250 r/min振摇至菌浓度A600 nm为2～8. 离心收集菌体弃去BMGY 培养液，换15 mL BMMY （13.4 g/L YNB；4×10-5 g/L生物素；100 mL/L磷酸缓冲液，10 mL/L甲醇）培养液. 30℃,250 r/min振摇，开始诱导表达，每24 h补充甲醇至终浓度为5 mL/L，于0,24,48,72,96和120 h分别取1 mL上清液，以此来比较在不同诱导时间表达量的高低. 同时用pPIC9K空质粒转入的毕赤酵母宿主菌SMD1168，在相同条件下诱导表达作为阴性对照，用SDSPAGE进行测定.

    2结果

    2．1PCR扩增CPA1活性中心基因及重组质粒pPIC9KCPA1active center的酶切鉴定PCR扩增CPA1活性中心基因，扩增产物经15 g/L琼脂糖凝胶电泳后，出现一条约606 bp的特异条带，与预期结果大小相符(图1). PCR产物克隆入载体pPIC9K，转化DH5α感受态细胞. 随机挑取2个白色菌落，于含适量氨苄青霉素的LB液中培养增菌8 h，提取质粒，经EcoR I和Not I双酶切后，切出约606 bp片段(图2). 经序列测定分析，结果与已知序列相比有两处碱基不同：第607位是TC转换、第1024位是CT转换，但其所编码的氨基酸没发生改变.

    2.2PCR分析CPA1活性中心基因与毕赤酵母（SMD1168）染色体基因组的整合通过G418(0.5～4.0 g/L)压力筛选出最高能抗4.0 g/L G418的重组子. 根据同源重组一个载体约抵抗0．25 g/L G418估算，同源重组入同一酵母菌的pPIC9KCPA1active center串联拷贝数最高可达到l6个. 提取重组子总DNA，通过PCR进一步鉴定重组子. CPA1活性中心基因稳定整合到毕赤酵母染色体基因组中，同时用毕赤酵母菌SMDI1168和pPIC9K分别做对照（图3）.

    2．3CPA1活性中心基因在毕赤酵母中的表达取BMMY培养液上清与2×上样缓冲液等体积混匀，100℃加热3 min，冷却后取20 μL上样，做SDSPAGE电泳,同时用pPIC9K空质粒做阴性对照. 结果显示在标准marker Mr 27×103左右出现一条表达条带，与预期相符，而阴性对照无此条带（图4）. 经薄层扫描仪测定，表达蛋白占培养液上清中总蛋白的45%（96 h）.

    3讨论

    毕赤酵母是一种嗜甲醇酵母，是在研究中广泛应用的一种表达宿主. 它能以甲醇作为唯一的能源和碳源，可以在含有甲醇的培养基中生长，甲醇能迅速诱导巴氏毕赤酵母合成大量的乙醇氧化酶，催化甲醇被氧化成甲醛和过氧化氢. 毕赤酵母表达系统既具有原核细胞的可操作性特点，也具有真核细胞的翻译后加工能力，可对重组蛋白进行糖基化处理，是重组蛋白的较理想的表达体系，且宿主细胞自身分泌蛋白量较少，为样品的纯化提供了方便［5］. 本次研究我们选用pPIC9K及SMD1168（his4，pep4）毕赤酵母菌作为CPA1活性中心蛋白的表达系统. pPIC9K具有αfactor分泌信号肽，能分泌表达目标蛋白，使产物获得较为方便，载体中引入Tnq03 Kanr基因(抗G418)有助于筛选高拷贝转化子. SMD1168 (his4，pep4)宿主菌染色体基因组中his4和pep4基因缺失，his4基因缺失使组氨醇脱氢酶合成受阻，代谢途径在组氨醇向组氨酸转化这一步被阻断，只能在含有组氨酸的培养基中生长，而pPIC9K表达载体中含有一段编码his4筛选基因，因此可在缺组氡酸的MD平板上筛选重组子；pep4是与S．cerevisiae蛋白水解酶A同源的基因，pep4缺陷型菌株使表达蛋白的降解受到抑制，因此表达的目的蛋白不会被降解. 依据以上理论，我们在酵母表达液上清中获得了预期分子质量的目的蛋白，但SDSPAGE结果显示蛋白条带浓度不高，因此，在后期的功能实验中，要对上清中的蛋白进行浓缩处理.

    【】

［1］ Barrett AJ，Rrawlings ND，Woessner JF．Handbook of Proteolytic Enzyine［M］．San Diego：Academic Press，1998：1318-1335．
［2］ Joshi L，St Leger RJ．Cloning，expression，and substrate specificity of MeCPA，a zinc   carboxypeptidase that is secreted into infected tissues by the fungal entomopathogen Metarhizium anisopliae［J］．J Biol Chem，1999，274(14)：9803-9811．
［3］ 岳乔红，于文彬，郝晓柯，等. 人羧肽酶A1活性中心基因的克隆及原核表达［J］. 第四军医大学学报，2003，24（23）：2132-2135.
［4］ Wei S，Segura S，Vendrell J，et al．Identification and characterization of three members of the human metallocarboxypeptidase gene family［J］．J Biol Chem，2002，277(17)：14954-14964．
［5］ Cereghino JL， Cregg JM. Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris［J］. FEMS Microbiol Rev，2000，24（1）：45-66.