PEP
作者：丁鹏，王家宁，黄永章，骆丽娜，邵芳
【关键词】 ,超氧化物歧化酶
Transduction of human Cu, Znsuperoxide dismutase mediated by an PEP1 peptide into endothelial cells of human umbilical vein
【Abstract】 AIM: To construct a prokaryotic expression system of pET15bPEP1SOD1, and to determine whether the expressed PEP1SOD1 fusion protein can be transduced into cells. METHODS: SOD1 cDNA was amplified by PCR using pBluescript II SKSOD1 as template, and digested with restriction endonuclease to construct recombinant plasmids pET15bSOD1 and pET15bPEP1SOD1, followed by being respectively transformed into E.coli to produce SOD1 and PEP1SOD1 fusion proteins, which were purified and added in cultured endothelial cells of human umbilical vein in vitro. RESULTS: The highly purified and active SOD1 and PEP1SOD1 fusion proteins were obtained.The PEP1SOD1 fusion protein could enter endothelial cells of human umbilical vein in a time and dosedependent manner when added exogenously in a culture media. Once inside the cells, PEP1SOD1 protein was enzymatically stable for 48 h. CONCLUSION: PEP1SOD1 fusion protein can be transduced effectively into endothelial cells of human umbilical vein, which provides a basis for future study involving direct delivery of SOD1 protein into tissues for therapy.
【Keywords】 superoxide dismutase； prokaryotic expression； PEP1 peptide； fusion protein
【摘要】 目的：构建原核表达载体pET15bPEP1SOD1，观察表达的融合蛋白PEP1SOD1能否进入细胞. 方法：以pBluescript II SKSOD1质粒为模板, PCR扩增SOD1 cDNA. 经酶切后分别构建原核表达载体pET15bSOD1和pET15bPEP1SOD1，分别转化大肠杆菌,表达SOD1和PEP1SOD1融合蛋白，将鉴定和纯化后的融合蛋白加入体外培养的人脐静脉内皮细胞. 结果：得到高纯度的、有活性的SOD1和PEP1SOD1融合蛋白. PEP1SOD1融合蛋白能高效地转导入体外培养的人脐静脉内皮细胞，并表现出剂量依赖性和时间依赖性的特点；一旦进入细胞，PEP1SOD1融合蛋白可以维持48 h. 结论： PEP1SOD1融合蛋白能高效地转导入体外培养的人脐静脉内皮细胞，为SOD1进入组织细胞内发挥作用提供了实验基础.
【关键词】 超氧化物歧化酶；原核表达；PEP1肽；融合蛋白
0引言
超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）是清除细胞内自由基, 保护细胞免受氧化应激损伤的关键酶之一［1］. 哺乳类动物细胞含有3种SOD［2］，即胞浆中的Cu,ZnSOD（SOD1），线粒体中的MnSOD（SOD2）和细胞外的Cu,ZnSOD（ECSOD1, SOD3）. SOD1是细胞中高水平表达的SOD, 是SOD的主要形式. 长期以来人们希望应用SOD1来防治各种氧化应激性损伤，但SOD1系生物大分子，在生物体内无特异受体和通道，也不能依靠内吞作用等入胞方式进入细胞内. 如何对SOD1分子进行改造，以便使其进入细胞内发挥功效，具有重要的实际意义. Morris研究小组设计的一种称为PEP1的转导肽（KETWWETWWTEWSQPKKKRKV）［3］，当将PEP1肽与靶蛋白（GFP，βgal）混合后加入培养的细胞，未变性的具有天然活性的靶蛋白被高效地导入了细胞内.
本研究通过基因工程手段构建了pET15bPEP1SOD1原核表达载体，制备纯化的PEP1SOD1融合蛋白，将PEP1SOD1加入体外培养的人脐静脉内皮细胞中，观察其穿透细胞的能力.
1材料和方法
1.1材料①质粒、菌株和引物：pBluescript II SKSOD1质粒由美国西奈山医学院生物化学与药系白景香博士惠赠；pGEMT easy vector系统购自美国Promega公司；pET15b, E.coli BL21(DE3)购自美国Novagen公司；大肠杆菌DH5α由本临床医学研究所提供；人脐静脉内皮细胞株购自美国ATCC. 根据GenBank中登录号为“AB087266”的人SOD1 cDNA序列,设计5′端分别加有XhoⅠ和BamHⅠ酶切位点的两条PCR引物, P1: 5′CTCGAGGCGACGAAGGCCGTGTGCGT3′；P2: 5′GGATCCTTATTGGGCGATCCCAATTA3′，引物由北京赛百盛基因技术有限公司合成. 根据Morris研究小组设计的PEP1转导肽（KETWWETWWTEWSQPKKKRKV），由北京赛百盛基因技术有限公司合成编码PEP1转导肽的两条寡核苷酸链：(正义链) 5′TATGAAAGAAACCTGGTGGGAAACCTGGTGGACCGAATGGTCTCAGCCGAAAAAAAAACGTAAAGTGC3′, 5′端加有NdeⅠ的酶切位点；(反义链) 5′TCGAGCACTTTACGTTTTTTTTTCGGCTGAGACCATTCGGTCCACCAGGTTTCCCACCAGGTTTCTTTCC3′，5′端加有XhoⅠ的酶切位点. ②主要试剂：限制性内切酶XhoⅠ, BamHⅠ, NdeⅠ和XbaⅠ购自北京赛百盛基因技术有限公司；LigaFast rapid DNA ligation system，IPTG均购自美国Promega 公司；pfu DNA聚合酶购自New England Biolabs公司；Hisprobe(G18)购自美国Santa Cruz Biotechnology公司；预染蛋白分子量标准(P0066)购自碧云天公司；Western blot检测试剂盒购自美国KPL公司；SOD活性测定试剂盒购自南京聚力生物医学工程研究所.
1.2方法
1.2.1构建原核表达载体pET15bSOD1和pET15bPEP1SOD1以pBluescript II SKSOD1质粒为模板,以引物P1，P2进行PCR扩增,扩增条件：起始变性94℃ 5 min,反应条件:94℃ 30 s, 60℃ 30 s, 72℃ 45 s,30个循环, 72℃延伸10 min. 纯化后的PCR产物采用TA克隆的方法［4］与pGEMT Easy载体连接构建 pGEMT EasySOD1. pGEMT EasySOD1和pET15b质粒分别用Xho I和BamH I双酶切,回收470 bp SOD1和线性化的 pET15b片段,由T4 DNA酶连接构建pET15bSOD1重组质粒. 连接产物转化DH5α,提取并纯化质粒, 进行酶切、测序鉴定. 将编码PEP1的两条寡核苷酸链通过煮沸后逐渐降至室温的方法复性为双链，然后与NdeⅠ， XhoⅠ双酶切消化的pET15bSOD1直接连接,构建pET15bPEP1SOD1重组质粒. 连接产物转化DH5α,提取并纯化质粒，寄往上海基康基因技术有限公司进行测序.
1.2.2SOD1，PEP1SOD1融合蛋白的表达、纯化和鉴定分别将pET15bSOD1和pET15bPEP1SOD1重组质粒转化E.coli BL21，铺在含氨苄青霉素（100 mg/L）的TB培养基中培养12 h，挑取单个菌落至100 mL含氨苄青霉素（100 mg/L）的LB培养液中37℃放大培养. 当细菌生长至A600为0.5~1.0时加入0.83 mol/L IPTG至终浓度0.83 mmol/L，置30℃诱导培养12 h. 4℃ 5000 r/min离心10 min，收集菌体，用PBS洗涤3次. 将收集的菌体溶于30 mL结合缓冲液（5 mmol/L imidazole, 500 mmol/L NaCl, 20 mmol/L TrisHCl, pH 7.9），400 W, 10s, 间隔20s，4℃超声破菌30 min. 破菌完全的菌液较澄清，置超速冷冻离心机中20 000 r/min, 4℃离心10 min. 表达的融合蛋白以天然的、可溶性的结构形式存在于上清中，将上清缓慢加入Ni2+亲和层析柱，上样完毕后，静置2 h，以便使融合蛋白上的6个组氨酸标签与层析柱内的Ni2+充分结合. 用10倍体积的结合缓冲液和6倍体积的漂洗缓冲液（60 mmol/L imidazole, 500 mmol/L NaCl, 20 mmol/L TrisHCl, pH 7.9）分别过柱，洗去未结合的杂蛋白，然后用洗脱缓冲液（1 mol/L imidazole, 500 mmol/L NaCl, 20 mmol/L TrisHCl, pH 7.9）洗脱融合蛋白.
收集洗脱峰值的洗脱液行120 g/L SDSPAGE，双份点样，将左侧凝胶置于考马斯亮蓝R250 液中染色；右侧凝胶行100 mA转膜2 h,取出膜加入兔抗多聚组氨酸抗体（1∶1000）于室温下孵育过夜，加入山羊抗兔抗体（1∶1000）室温下孵育2 h,然后显色. 在证实含有融合蛋白的洗脱液中加入甘油至终浓度100 mL/L，混匀装入透析袋中，置入含100 mL/L甘油的PBS中4℃透析脱盐24 h. 以牛血清白蛋白(1 mg/mL)做对照，采用Bradford方法［5］测定SOD1和PEP1SOD1融合蛋白的浓度. 然后将SOD1和PEP1SOD1融合蛋白分装于1.5 mL eppendorf管内，置－80℃保存备用.
1.2.3SOD1和PEP1SOD1的酶活性测定取SOD1和PEP1SOD1融合蛋白，用黄嘌呤氧化酶法（SOD测试盒）测定其酶活性.
1.2.4PEP1SOD1转导入人脐静脉内皮细胞人脐静脉内皮细胞在含100 mL/L小牛血清的DMEM培养基中，37℃，50 mL/L CO2培养箱培养，待细胞生长至完全融合时，2.5 g/L胰酶消化，更换新培养基，移入6空板中（2 mL/孔），融合生长4～6 h后进行实验. ①检测转导的PEP1SOD1的剂量依赖性：分别往培养基中加入SOD1和PEP1SOD1至不同的终浓度（0.25～2 μmol/L），置于50 mL/L CO2培养箱中，37℃孵育30 min. 用胰酶EDTA处理细胞，PBS洗涤细胞以除去未转导的融合蛋白，然后收集细胞提取物行Western blot分析. ②检测转导的PEP1SOD1的时间依赖性：分别往培养基中加入SOD1和PEP1SOD1至终浓度2 μmol/L，置于50 mL/L CO2培养箱中，37℃孵育不同时间（5～30 min），用胰酶EDTA处理细胞，PBS洗涤细胞以除去未转导的融合蛋白，然后收集细胞提取物行Western blot分析. ③检测转导的PEP1SOD1在细胞内的稳定性：分别往培养基中加入SOD1和PEP1SOD1至终浓度2 μmol/L，置于50 mL/L CO2培养箱中，37℃孵育1 h，用胰酶EDTA处理细胞，PBS洗涤细胞以除去未转导的融合蛋白，然后更换新培养基继续培养. 在不同的时间点（1～48 h）收集细胞，将收集的细胞提取物行Western blot分析.
2结果
2.1构建原核表达载体pET15bPEP1SOD1重组质粒的构建（图1A），同时制备出不带PEP1的SOD1作为对照（图1B）. 测序结果表明: PEP1和人SOD1 cDNA编码区均成功地克隆入pET15b质粒，而且其序列分别与我们设计合成的PEP1和GenBank“AB087266”登录的人SOD1 cDNA序列完全一致(图2).
图1PEP1SOD1的表达载体（A）构建表达载体pET15bPEP1SOD1，PEP1编码区插入NdeⅠ，XhoⅠ位点，人SOD1 cDNA插入Xho I，BamH I位点；（B）表达的SOD1和PEP1SOD1融合蛋白示图（略）
图2pET15bPEP1SOD1原核表达质粒的部分核苷酸序列正向测定结果（略）
AM：DNA Marker；1：纯化前的pSOD1；2：纯化后的pSOD1；3：纯化前的pPEP1SOD1；4: 纯化后的pPEP1SOD1. BM：DNA Marker；1：纯化后的pSOD1；2：纯化后的pPEP1SOD1.
图3细菌的蛋白提取物和纯化的融合蛋白行120g/L SDSPAGE分析（A）和Western blot分析（B）（略）
2.2融合蛋的SDSPAGE和Western blot分析pET15bSOD1和pET15bPEP1SOD1重组质粒分别转化E.coli BL21，在IPTG诱导下，能稳定而高效地分别表达SOD1和PEP1SOD1融合蛋白，行120 g/L SDSPAGE和Western blot结果表明（图3A，B），分别在22 ku和26 ku出现SOD1和PEP1SOD1目标表达条带，而且两种表达蛋白以天然的、可溶性的形式存在，表达的融合蛋白占细菌总蛋白的30％. 采用Bradford法测得SOD1和PEP1SOD1融合蛋白的产量分别为155.4 g/L和207.2 g/L菌液.
2.3融合蛋白的活性测定黄嘌呤氧化酶法测定结果表明，纯化后的SOD1和PEP1SOD1融合蛋白均具有SOD1酶活性，其活性分别为1.574×104 U/g和1.201×104 U/g.
2.4PEP1SOD1转导入人脐静脉内皮细胞
2.4.1转导的PEP1SOD1的剂量依赖性Western blot结果（图4A）：PEP1SOD1组，转导入人脐静脉内皮细胞内蛋白的量随着加入PEP1SOD1的蛋白浓度（0.25～2.00 μmol/L）增加而增加，表现出剂量依赖性的特点；SOD1组，无论培养基中SOD1的蛋白浓度（0.25～2.00 μmol/L）如何增加，SOD1都无法进入细胞.
2.4.2转导的PEP1SOD1的时间依赖性Western blot结果（图4B）：PEP1SOD1组，转导入人脐静脉内皮细胞内蛋白的量随着PEP1SOD1与细胞的孵育时间（2 μmol/L ，5～30 min）增加而增加，5 min细胞内即检测到转导的蛋白，且表现出时间依赖性的特点；SOD1组，无论SOD1蛋白与细胞的孵育时间（5～30 min）如何增加，SOD1都无法进入细胞.
A: 分别加入SOD1和PEP1SOD1至不同的终浓度（0.25～2.00 μmol/L），孵育30 min； B: 分别加入SOD1和PEP1SOD1融合蛋白至终浓度2.00 μmol/L，孵育（5～30 min）.
图4PEP1SOD1转导入培养的人脐静脉内皮细胞（略）
2.4.3转导的PEP1SOD1在细胞内的稳定性Western blot结果（图5）：检测转导入人脐静脉内皮细胞内蛋白的量在1 h组最大，以后随着时间（2.00 μmol/L ，1～48 h）延长而减少，但PEP1SOD1蛋白可以在细胞内维持48 h.
图5转导的PEP1SOD1在人脐静脉内皮细胞内的稳定性，细胞用2.00 μmol/L PEP1SOD1预处理，孵育不同的时间（1～48 h）（略）
3讨论
最近研究发现，某些蛋白质区域具有将外源性蛋白导入细胞内的特性，这些区域称为蛋白转导域（protein transduction domain, PTD），如HIV1 Tat，果蝇触角足蛋白(Antp)，HSV VP22蛋白. Choi SY领导的研究小组也证实了TatGFP，TatSOD融合蛋白高效地导入哺乳动物的细胞和皮肤组织［6-7］. 但TatPTD介导的蛋白转导需要融合蛋白在导入前进行变性，才能使融合蛋白进入细胞内. 变性的Tat融合蛋白进入细胞内后，通过HSP90蛋白把靶蛋白重折叠为天然有活性的构象，因此导入蛋白的生物活性依赖于HSP90分子伴侣的重折叠效率［8］，从而限制了导入蛋白的生物活性.
本研究成功地构建了原核表达质粒pET15bSOD1和pET15bPEP1SOD1，pET15bSOD1的构建是为pET15bPEP1SOD1提供对照，从而客观地评价PEP1转导肽的转导效率. 重组质粒表达出与6个组氨酸标签相融合的SOD1，利用pET15b质粒N端的6个组氨酸残基可以对表达的HistagSOD1和HistagPEP1SOD1进行Ni2+柱层析和检测，从而简化了该蛋白的分离及纯化工艺. 将两种重组质粒分别转化E.coli BL21，能稳定而高效地分别表达SOD1和PEP1SOD1融合蛋白，表达蛋白以天然的、可溶性的形式存在，而且表达的融合蛋白占菌体总蛋白的30％. 采用Bradford法测得SOD1和PEP1SOD1的产量分别为155.4 g/L和207.2 g/L菌液. 黄嘌呤氧化酶法测定结果表明，表达的SOD1和PEP1SOD1均具有较高的SOD1酶活性，其活性分别为1.574×104 U/g和1.201×104 U/g. 细胞转导试验结果表明，PEP1能高效地介导SOD1进入体外培养的人脐静脉内皮细胞，并具有剂量依赖性和时间依赖性的特点；在细胞内，PEP1SOD1融合蛋白可以稳定的维持48 h，而不带PEP1的SOD1无法进入细胞.
本课题采用基因工程方法制备PEP1SOD1，方法可行，价廉，避免了大规模合成PEP1所需的难以承受的费用，容易产业化生产PEP1SOD1. 制备的PEP1SOD1是以天然活性状态进入细胞内，无需细胞内分子伴侣的作用，从而提高了转导的SOD1进入细胞后的生物活性，为SOD1进入组织细胞内发挥作用提供了实验基础.
【】
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