依托昔布对大鼠单侧输尿管梗阻肾脏病变的影响

【摘要】  　　目的：观察选择性环氧化酶?2抑制剂依托昔布对单侧输尿管梗阻大鼠肾脏病变的影响. 方法：将大鼠随机分为单侧输尿管梗阻组，依托昔布组和对照组进行实验，测定血肌酐、尿素氮和肾皮质NO含量，并用免疫组化法半定量测定肾组织TGF?β1和COX?2的表达水平. 结果：单侧输尿管结扎术后3 wk，单侧输尿管梗阻组和用药组大鼠肾脏均可见明显病理改变与纤维化，血肌酐［（38.10±3.93，27.80±2.57） mL/min］、尿素氮［（9.18±0.03，8.14±0.03） mmol/L］和肾皮质NO含量［（6.01±0.17，4.47±0.12） mmol/L］均比对照组［(22.30±2.28) mL/min, (6.53±0.02) mmol/L, （1.65±0.11） mmol/L］显著性升高，肾组织TGF?β1（2.41±0.19，1.38±0.13）和COX?2（2.74±0.07，1.52±0.05）的表达水平显著性上调. 用药组与单侧输尿管梗阻组比较，病理改变与纤维化程度，血肌酐、尿素氮和肾皮质NO含量、肾组织TGF?β1和COX?2的表达水平差异有统计学意义（P<0.05）. 结论：特异性COX?2抑制剂依托昔布能减轻单侧输尿管梗阻大鼠肾脏病理损伤和纤维化改变.

【关键词】  输尿管梗阻 纤维化 环氧化酶?2 依托昔布

      0引言

    环氧化酶(cyclooxygenase, COX)包括 COX?1和COX?2两种同工酶，目前认为是前列腺素代谢环节中的关键性限速酶，COX?1参与正常生理过程，而COX?2可介导病理改变［1］. 研究结果显示，COX?2大量生成在输尿管梗阻所引发的肾小管间质纤维化过程中起重要作用［2］，并发现COX?2在肾皮质的过度表达可能是肾内炎性细胞浸润和聚集的起始或促进因素之一. 而临床上用非甾体类抗炎药(nonsteroid anti?inflammatory drugs, NSAIDs)治疗肾脏炎性疾病引起不良反应可能与NSAIDs在阻断COX?2催化的病理性前列腺素合成的同时，也阻断了COX?1催化的生理性前列腺素的合成有关. 为了探讨通过选择性地阻断COX?2的合成，避免NSAIDs的不良反应的有效途径［3］，我们用单侧输尿管梗阻大鼠模型［4］，观察肾组织中COX?2和TGF?β1的改变及其在输尿管梗阻所致肾损伤的发生中的作用，并观察选择性COX?2抑制剂依托昔布(Etoricoxib)对梗阻性肾病发生发展的影响及对肾脏的保护作用，为治疗相关肾脏损伤提供基础.

    1材料和方法

    1.1材料健康雄性SD大鼠30只，体质量180~220 g，医学院实验动物中心提供，饲养环境保持通风，湿度55%，温度22℃，昼夜灯光照明，定期消毒笼具. 依托昔布由北京欣经科生物技术有限公司提供. 山羊抗大鼠COX?2多克隆抗体、兔抗大鼠TGF?β1多克隆抗体为Santa Crutz公司产品.

    1.2方法

    1.2.1单侧输尿管梗阻模型动物平均分为对照组、单侧输尿管梗阻组和依托昔布治疗组. 对照组除不结扎和剪断输尿管外，其余步骤同其它两组. 治疗组于术前24 h开始给予依托昔布，每日10 mg/kg溶于1  mL生理盐水中灌胃，梗阻组仅以等量生理盐水灌胃. 0.1 g/L水合氯醛350 mg/kg腹腔注射麻醉梗阻组和依托昔布治疗组大鼠. 于背部左侧纵形切开皮肤，钝性分离肌肉，暴露左侧肾脏，分离输尿管，分别在紧贴肾门处及远端结扎输尿管，于两结扎处之间剪断，逐层缝合肌肉、皮肤，以碘伏消毒. 术后肌肉注射罗氏芬预防感染，每日1.5 mg/kg，连续3 d. 肾脏取材与保存：术后第3周，在采集血液标本后，手术取出大鼠左肾，剥离肾包膜，将肾脏沿纵轴剖开，取适量皮质组织作NO含量测定用，其余组织迅速保存在中性甲醛中以备组织学染色和免疫组织化学染色用.

    1.2.2血液生化指标测定将术后第3周采集血液标本离心，取血清，在全自动生化分析仪上测定血肌酐与尿素氮.

    1.2.3肾皮质NO含量测定取约0.5 g左肾组织，加入4 mL 4℃生理盐水中，用玻璃匀浆器在冰水浴中研磨制成匀浆，4℃，1000 r/min，离心5 min，取上清液-20℃保存待测. 用硝酸还原酶法测定NO含量，按试剂盒检测步骤，分别在空白管，标准管，测定管中滴加试剂，混匀，37℃水浴60 min，再次滴加试剂，充分旋涡混匀30 s，室温静置10 min, 4000 r/min离心10 min，取上清，分别加入显色剂，混匀，室温静置10 min，蒸馏水调零，550 nm, 0.5 cm光径比色测定各管吸光度值，NO含量（μmol/L)=［(样品管吸光度-空白管吸光度)或(标准管吸光度-空白管吸光度)×标准值］÷样品的蛋白浓度(g/L).

    1.2.4Masson和免疫组织化学染色肾组织固定后石蜡包埋. 3 μm连续切片. Masson染色：切片脱蜡水化，蒸馏水浸洗3次，每次3 min. 用Masson复合染液浸染10 min，冰醋酸冲洗. 磷钨酸分化10 min，冰醋酸冲洗. 苯胺蓝染色4 min，冰醋酸冲洗. 最后用蒸馏水浸洗2次，每次5 min. 干燥后用中性树胶封片. 免疫组织化学染色：切片脱蜡水化后， 用PBS (pH 7.4， 10 mmol/L)浸洗. 内源性过氧化物酶阻断剂室温孵育，PBS洗后浸入柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0, 10 mmol/L)，微波修复(2450 mHz, 800 W)，加蒸馏水50 mL后冷却. PBS液浸洗；用正常山羊血清封闭，室温孵育. 倾去血清，加入一抗（兔抗大鼠TGF?β1抗体，1∶400稀释；山羊抗大鼠COX?2抗体，1∶100稀释），4℃冰箱过夜，复温, PBS浸洗. 滴加生物素化抗兔或抗山羊二抗，室温孵育. PBS液浸洗，再滴加链霉菌抗生物素蛋白?过氧化物酶，室温孵育. PBS液浸洗，显色剂DAB显色，自来水充分冲洗，苏木素复染，二甲苯透明，中性树胶封片，光镜下观察. 以正常兔或山羊血清代替一抗作阴性对照，免疫组化结果均为阴性.

    1.2.5结果判定肾小管间质病变（肾小管扩张或萎缩、间质细胞浸润及间质纤维化）程度的判定按Priraini法评分（0分：小管间质无病变；1分：轻度病变，范围<20%；2分：中度病变，范围20%~40%; 3分：重度，病变范围>40%）. 每例切片记录连续不重叠的20个低倍视野的数值，取平均值. 对TGF?β1和COX?2的表达，根据着色范围进行半定量分析（0分：无着色；0.5分：微量着色，面积占整个视野的10%以下；1分：轻度着色，着色面积占整个视野的10%~30%；2分：中度着色，着色面积占整个视野的30%~50%；3分：广泛着色，着色面积占整个视野的50%以上）. 每例切片记录20个连续不重叠的肾皮质间质高倍视野（尽量避开肾小球和大血管），取平均值.

    统计学处理：实验数据用x±s表示，用SPSS 10.0做统计分析， 所用统计方法为方差分析， P<0.05为检验水准.

    2结果

    2.1肾脏大体形态与病所见梗阻组动物左侧肾脏输尿管结扎术后3 wk，肾脏明显肿大，颜色变浅，剖面呈缺血状，以肾皮质为重. 肾盂、肾盏扩张明显，充满尿液，肾实质变薄，皮髓质界限模糊不清. 经Masson染色后对照组比较，肾间质明显增宽，其中有大量炎症细胞浸润，间质纤维化明显. 与组比较，依托昔布能够明显地改善单侧输尿管梗阻时的病理改变，镜下可见间质内炎症细胞减少，纤维化明显减轻.

    2.2生化指标输尿管结扎术后3 wk，梗阻组和治疗组尿素氮与血肌酐定量均比对照组升高，差异有统计学意义(P<0.01)，表明梗阻性肾的损伤. 而治疗组与梗阻组之间尿素氮与血肌酐定量差异有统计学意义(P<0.05)，表明依托昔布对肾损伤有保护作用(表1).

    2.3肾组织匀浆NO含量变化术后3 wk， 三组比较， 肾皮质匀浆NO2-/NO3-含量变化非常显著， 治疗组与梗阻组比较， 差异有统计学意义(P<0.05， 表1). 表明NO参与了梗阻性肾损伤的发生过程， 而依托昔布可以降低NO的合成. 表1尿素氮、血肌酐、NO含量及TGF?β1 COX?2半定量计分比较

    2.4肾小管间质TGF?β1的表达术后3 wk，三组比较，肾小管间质TGF?β1表达的免疫组织化学染色半定量计分差异有统计学意义(P<0.05). 梗阻组与治疗组比较差异有统计学意义(P<0.05,表1). 表明TGF?β1参与了梗阻性肾损伤的发生发展过程，而依托昔布可以降低TGF?β1的生成.

    2.5肾小管间质COX?2的表达治疗组和梗阻组与对照组比较COX?2表达明显增加，而治疗组和梗阻组之间差异亦有统计学意义(P<0.01，表1). 表明COX?2参与了梗阻性肾损伤的发生发展过程，而依托昔布可以减少COX?2的生成.

    3讨论

    本研究中，单侧输尿管梗阻大鼠在其梗阻3 wk后，可见肾间质增宽，炎症细胞浸润，部分肾小管萎缩，肾小管间质明显纤维化，血肌酐与尿素氮水平上升，表明肾功能受损. 肾皮质匀浆NO含量升高，肾小管间质TGF?β1的表达和COX?2的表达上调，提示二者参与了肾损伤的发生发展. 单侧输尿管梗阻后使用依托昔布的大鼠，肾功能损伤和肾小管间质纤维化程度明显减轻. 据此我们推论,依托昔布对于大鼠单侧输尿管梗阻病变具有保护作用.

     目前已经开发出多种选择性COX?2抑制剂（可分为第一代和第二代），临床上主要用于治疗风湿性关节炎和骨关节炎［5-6］，然而有关选择性抑制COX?2对各种肾脏疾病影响的研究较少. 有关学者［7-8］用大鼠肾大部切除2 wk的模型研究发现，肾脏致密斑及皮质升支粗段的COX?2表达显著增加,而COX?1无明显变化；使用COX?2抑制剂可以有效减少前列腺素的生成，延缓肾小球硬化的病程进展. 而用COX?1抑制剂却无效. 有关学者［9］提出，COX?2在单侧输尿管梗阻小鼠肾皮质的过度表达很可能是肾内炎性细胞浸润和积聚的起始或促进因素之一，但迄今尚未见COX?2与肾小管间质纤维化的相关性研究报道. 本研究表明，COX?2参与了单侧输尿管梗阻后肾损伤发生和发展的病理过程，并在大鼠梗阻性肾损伤的肾间质纤维化的过程中有重要作用. 同时发现，第二代高特异性COX?2抑制剂依托昔布能够减轻肾功能损伤和肾组织纤维化进展，抑制NO活性，下调TGF?β1和COX?2的表达，从多方面发挥对梗阻性肾损伤的保护作用.

【】
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