银杏叶提取物对MPP+诱导的中脑多巴胺能神经细胞损伤的保护作用

                                              作者：奚淑芳,陈建宗,王百忍,杨浩,高建苑,田季雨,康小刚

【关键词】  帕金森病

    Protective effect of EGB761 on embryonic rat mesencephalic dopaminergic neurons in vitro from  MPP+induced injury

　　【Abstract】 AIM: To explore whether the ginkgo biloba extract (EGB761) could partially protect embryonic rat mesencephalic dopaminergic (DAergic) neurons from MPP+induced injury. METHODS:  Primarily cultured cells were dissociated from embryonic rat mesencephalon and the cells were treated by addition of EGB761 and MPP+. The viability of mesencephalic primary cells and DAergic neurons was assessed by MTT assay and the survival number of tyrosine hydroxylase (TH) positive cells was evaluated by immunocytochemistry. The level of nitric oxide (NO) was assessed by immunocytochemistry for inducible nitric oxide synthase (iNOS). RESULTS:  The number of THpositive cells and the viability of mesencephalic cells significantly decreased while the number of iNOS cells increased in the development of apoptosis induced by MPP+. The adding of EGB761 significantly reversed these changes caused by MPP+. CONCLUSION:  EGB761 can protect embryonic rat mesencephalic DAergic neurons against MPP+induced apoptotic death in a dosedependent manner.

　　【Keywords】 ginkgo biloba; plant; extract; mesencephalic; cells, cultured; Parkinsons disease; 1methyl4phenylpyridiniumion

　　【摘要】 目的：探讨银杏叶提取物（EGB761）对1甲基4苯基吡啶离子（MPP+）诱导的帕金森病细胞模型是否具有保护作用. 方法：采用胚胎大鼠中脑原代细胞培养法，分离培养中脑神经细胞，随后进行EGB761及MPP+处理，最后通过3(4,5二甲基噻唑2)2,5二苯基四氮唑溴盐（MTT）微量比色法，酪氨酸羟化酶（TH）免疫细胞化学，研究EGB761对MPP+损伤后的中脑原代培养细胞及DA能神经细胞活性的影响，同时进行iNOS免疫细胞化学法，了解iNOS的表达情况. 结果：在MPP+诱导的中脑原代细胞凋亡中，MPP+组TH阳性细胞数及细胞存活率均显著低于各EGB761组及阳性对照组(P<0.01). 而iNOS的表达则显著多于各EGB761组（P<0.01）. 结论：EGB761对MPP+诱导的胚胎大鼠中脑原代培养细胞损伤具有保护作用，且此作用有随剂量的增大而增加的趋势.

　　【关键词】 银杏叶;植物；提取物；中脑；细胞，培养的；  帕金森病； 1甲基4苯基吡啶离子

　　0引言

　　帕金森病（Parkinsons disease, PD）是以中脑黑质致密带多巴胺（dopamine, DA）能神经元变性、脱失为主要特征的神经系统变性疾病. 其机制可能与黑质纹状体氧化应激反应增强和局部抗氧化保护机制减弱有关. 目前，PD的仍以症状治疗为主，还没有一种治疗能够延缓其病情的进展. 最近的研究发现，银杏叶提取物(EGB761)具有清除自由基和过氧化脂质、对抗兴奋性神经递质的释放、拮抗血小板活化因子等多种药理活性［1］，临床已广泛用于心脑血管疾病及老年痴呆症的治疗. 但是EGB761对中脑原代培养的DA能神经元活性及其代谢影响的报道甚少. 我们在前人研究的基础上，观察EGB761对1甲基4苯基吡啶离子(MPP+)诱导损伤的胚胎大鼠中脑原代细胞的作用，旨在了解EGB761对DA能神经元的影响，探讨其防治PD的可能性.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　孕16 d SD大鼠，由第四军医大学实验动物中心提供；EGB761（商品名金纳多注射液,17.5 mg/支）为德国威玛舒培博士药厂产品；酪氨酸羟化酶一抗（小鼠抗大鼠）、多聚赖氨酸等购自Sigma公司；3(4,5dimethylthiazol2yl)2,5diphenyltetrazolium bromide (MTT)、胎牛血清购自Gibco公司； iNOS一抗（兔抗大鼠）为Santa Cruz产品；神经生长因子（NGF）为Promage公司产品；SABC试剂盒为武汉博士德公司产品.

　　1.2方法

　　1.2.1中脑神经细胞的培养［2］并稍做改进，将孕16 d SD大鼠心脏内直接注射气栓致死，无菌分层解剖取出子宫，剪开子宫，取出胚胎，置于冰袋上盛有DHanks液的平皿中待用. 在解剖显微镜下轻轻剥出完整的脑组织，将腹侧面朝上，沿视神经根下沿和脑干部横切两刀，精细解剖镊分出中脑黑质部，将取下的组织平铺在盛有冰DHanks液的平皿中，再用精细解剖镊剔除残留脑膜及血管，静置于冰袋上待用. 整个取材时间不超过45 min. 将所取组织块剪碎后加入1.25 g/L胰蛋白酶（Trypsin 1∶250），于37℃, 50 mL/L CO2培养箱中温育25 min，然后在完全培养液（DMEM 800 mL/L，马血清100 mL/L，胎牛血清100 mL/L，DMEM中葡萄糖为6 g/L）中放置10 min以终止胰蛋白酶作用. 800 r/min离心5 min，吸弃上悬液，加培养液. 用火焰刨光的直头滴管吹打10次，静置沉淀大的组织块，吸取上悬液，调整细胞密度，按照2×105，1×105细胞/孔分种于涂有多聚赖氨酸的24孔和96孔塑料培养板内，置37℃，50 mL/L CO2培养箱内培养.

　　1.2.2药物处理接种3 d后，更换新鲜培养液（培养液DMEM中含100 mL/L胎牛血清），培养的标本随机分为对照组、阳性对照组（NGF组）、模型组（MPP+组）和EGB761组（EGB761大100 mg/L，中80 mg/L，小50 mg/L剂量组），每组拟设30孔进行iNOS染色，40孔进行TH染色，45孔进行MTT试验. EGB761组换液时培养液中加EGB761，使其终浓度分别为50，80，100 mg/L;阳性对照组加入NGF（终浓度50 μg/L）;模型组和对照组加入正常培养液. EGB761组、阳性对照组和模型组在接种后第6日加入MPP+，终浓度为200 μmol/L. 培养第7日再换液1次，所加药物同第1次换液，浓度不变.

　　1.2.3TH，iNOS免疫细胞组织化学观察药物处理后培养至第9日，将标本进行免疫细胞化学反应，先用PBS漂洗,用30 mL/L H2O2甲醇清除内源性过氧化物酶10 min，PBS洗5 min×3；加入小鼠抗大鼠TH抗体（1∶3000稀释）/兔抗大鼠iNOS抗体（1∶200稀释），4℃过夜，PBS洗3次，加入生物素化兔抗小鼠/羊抗兔IgG，室温作用4 h，PBS洗3次，加入SABC复合物，室温作用2 h，PBS洗3次，加即用型DAB显色剂于细胞中，在倒置显微镜下观察，用PBS代替一抗作为染色的空白对照组.

　　统计学处理：实验测定值用x±s表示，应用SPSS 10.0统计软件进行单因素方差分析，两两比较用LSD法检验，以P<0.05为有统计学意义.

　　2结果

　　2.1细胞形态学观察接种后，细胞最初呈圆形，核不可见，细胞分散，体积小，立体感强，悬浮于培养液中，不久细胞开始贴壁，至24 h基本全部贴壁，部分细胞突起生长. 3 d后，细胞形态多样，呈双极、三极、多极型，多数细胞可见带有分枝的细丝状突起. 加入MPP+损伤后，细胞先肿胀，折光度增强，后细胞圆缩、脱落. 培养至第9日，TH免疫组化染色后可见TH阳性细胞呈棕褐色，带有神经突起. 不同剂量的EGB761作用后的TH神经元数目略有不同（图1）.

　　2.2MTT比色法细胞培养至第8日，对照组细胞为40孔，MPP+组为42孔，NGF组为45孔，EGB761小剂量组为43孔，中剂量和大剂量组均为44孔. 在96孔培养板中每孔加10 μL MTT（5 g/L），继续培养4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加100 μL DMSO溶液终止MTT反应，振荡10 min，使MTT反应的蓝色结晶充分溶解，置Dynatech MR 4000型酶标仪测细胞吸光值（A值），采用检测波长570 nm，参考波长630 nm. 结果发现EGB761各组细胞A值显著高于MPP+处理组（P<0.01,表1）,而与NGF组无明显差别.表1不同处理因素下胚胎大鼠中脑原代细胞A值水平(略)

　　2.3TH免疫细胞化学观察按照常规SABC方法进行TH免疫细胞染色，显示TH阳性反应的是中脑DA能神经细胞，在显微镜下比较神经细胞的形态及反应程度，将各组随机选取40个孔，对标本进行TH阳性细胞记数并进行统计学处理，发现经不同剂量EGB761处理的TH阳性细胞数目均明显高于MPP＋组（P<0.01），NGF组TH阳性数也显著高于MPP+组(P<0.01). 大剂量EGB761组与NGF组比较TH阳性数无统计学差异（P>0.05）. EGB761与NGF均能降低MPP+对DA能神经元的损伤（表2）.表2不同处理因素下胚胎大鼠中脑原代细胞iNOS, TH阳性细胞数水平(略)

　　2.4iNOS免疫细胞化学观察按照常规SABC方法进行iNOS免疫细胞化学染色，将各组随机选取30个孔，对标本进行iNOS阳性细胞记数并进行统计学处理，发现MPP＋组iNOS表达显著高于对照组、EGB761各组及NGF组（P<0.01）. 提示EGB761与NGF对MPP+损伤的神经细胞均有保护作用（表2）.

　　3讨论

　　D的特征性病理改变是中脑黑质纹状体多巴胺能神经元的变性、坏死，导致DA能神经元数量的减少. 研究发现，左旋多巴对体外培养的神经元有促凋亡作用［3］. 药研究发现，EGB761能够清除自由基并能够抑制自由基的产生，降低病损细胞凋亡速度［4］ ,还可减少脑组织耗氧量，具有保护脑神经细胞膜的功效［1］. 但EGB761对体外培养的中脑原代细胞的作用少见报道. 体外神经细胞培养作为研究在体细胞的神经模型之一，具有安全性、重复性较好，影响因素较少，条件比较单一等优点. 而中脑原代细胞的培养与一些DA能细胞株（PC12，SHSY5Y，MES23.5）相比，更接近生理条件，能更好的模拟机体内环境. MPP+是线粒体呼吸链复合酶Ⅰ的可逆性抑制剂，能使细胞内ATP和GSH减少，破坏钙离子平衡，导致呼吸链产生自由基增多，引起多巴胺能神经元变性死亡［5］. 因此，本实验采用体外培养胚胎大鼠中脑原代细胞来观察EGB761对MPP+损伤的中脑原代细胞中DA能神经元的作用.

　　TH染色阳性细胞是DA能神经细胞功能存在的标志［6］. NO是一种自由基，也是一种信使分子，可通过多种途径作用于细胞凋亡通路. Liu等［7］研究发现，NO可以抑制细胞DNA合成，反应产物亚硝酸根离子（ONOO-）通过氧化和硝化作用选择性破坏蛋白质，如TH和αsynuclein，并可使DNA烷化，消耗ATP，最终导致神经细胞凋亡. BalPrice等［8］也发现NO可通过线粒体的损伤诱导PC12细胞凋亡. NOS有原生型（eNOS）和诱导型（iNOS），前者主要调节生理功能，后者在病理状态下产生，我们采用免疫细胞化学染色技术检测中脑原代培养细胞中iNOS的表达，并观察到EGB761可以明显降低MPP+损伤后iNOS的表达，从而降低NO的产生和细胞的凋亡. NGF是某些交感神经元和感觉神经元存活和发育所必须的生长因子，具有内源性神经保护和修复功能［9］. 在本实验中NGF发挥了对中脑原代细胞的保护作用.

　　本研究结果显示，EGB761可提高体外培养的胚胎大鼠中脑原代细胞的活性，并可能促进DA能神经生长，且能降低iNOS的表达，对抗细胞凋亡. 但其作用机制尚不明确，可能是通过降低NO的产生，部分阻断自由基产生的异常信号通路而减少细胞凋亡, 也可能是通过营养星形胶质细胞［10］促其合成神经营养因子，而起到对中脑原代培养细胞的营养作用. 总之，本研究发现EGB761可增加体外培养的DA能神经元活性，且其作用有剂量依赖性趋势，为EGB761防治PD提供了实验依据.

　　【】

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　　［4］ Xin W, Wei T, Chen C. Mechanisms of apoptosis in rat cerebellar granule cells induced by hydroxyl radicals and the effects of EGb761 and its constituents［J］. Toxicology, 2000，148(23):103-110.

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