人突变型p53和EB病毒LMP1转基因小鼠的建立
【关键词】 鼻咽癌前病变
Construction of transgenic mice containing human mutant p53 and EB virus latent membrane protein 1
【Abstract】 AIM: To establish bitransgenic mice models containing mutation p53 gene and EpsteinBarr (EB) virus latent membrane protein 1 gene （LMP1） and to provide reliable tools for studying the reciprocity of mutant p53 with LMP1 in the tumorogenesis process of nasopharyngeal precancerosis. METHODS: Molecular cloning techniques were used to construct the recombinant plasmid pLMP1p53mt containing mutant p53 gene and EB virus LMP1 gene. Linear recombinant plasmid pLMP1p53mt was transfected into mouse androgenesis of germ cells by microinjection and then survival germ cells treated were planted into fallopian tubes of artificial pregnant female mice. Threeweek filial generation mice were screened by PCR and further identified by southern blot, and the histopathological characteristics of different tissues in 4month transgenic mice were observed by HE staining. RESULTS: Seven hundred and seven mouse zygotes were treated with transgenic vectors DNA by microinjection and then transplanted into 30 artificial pregnant female mice. Twentysix of these mice were gravid. The transplantation rate was 86.67%. A total of 179 F0 mice were obtained, of which 9 were carried p53mt gene and LMP1 gene screened by PCR. The positive rate of transgenic mice was 5.03% (9/179). The 9 positive F0 mice carrying foreign genes were further confirmed by southern blot. The rhinal mucosa, nasopharyngeal tissues and oesophagus of one founder had inflammation and its nasopharynx mucosa had focal hyperplasia. CONCLUSION: Transgenic mouse models integrating human mutant p53 gene and LMP1 and with focal hyperplasia of nasopharynx mucosa have been established by microinjection, which provides an effective model in studying the mechanism of nasopharyngeal precancerous lesions.
【Keywords】 mutation p53 gene; latent membrane protein 1 gene; nasopharyngeal precarcinoma; transgenic mice
【摘要】 目的：建立含突变型p53和EB病毒LMP1基因的双转基因小鼠模型，为研究突变型p53和EB病毒LMP1基因在鼻咽癌前病变中的交互作用提供有力的工具. 方法：通过分子克隆技术构建含突变型p53基因和EB病毒LMP1基因的真核表达载体pLMP1p53mt；采用显微注射法将线性化的表达载体注射至小鼠受精卵的雄性原核中，然后将注射存活的受精卵植入假孕母鼠的输卵管；取其产3 wk龄子代鼠进行PCR初选，再通过Southern杂交进一步确证；利用HE染色法观察4 mo龄转基因小鼠不同组织病理变化. 结果：将转基因载体进行了707枚小鼠受精卵的显微注射，然后植入30只假孕母鼠的输卵管中，其中26只母鼠怀孕，移植成功率为86.67%；共出生子代鼠179只;PCR检测显示179只子代小鼠中有9只整合了p53mt和LMP1基因，转基因阳性小鼠比例为5.03％(9／179)，Southern杂交结果进一步证实了9只基因组整合了外源基因的首建者小鼠；随机抽取其中的1只转基因阳性小鼠鼻腔黏膜、鼻咽、食管表现炎症，鼻咽黏膜上皮灶性增生. 结论：成功建立整合人突变型p53和LMP1的转基因小鼠，且表现鼻咽黏膜上皮灶性增生，可为鼻咽癌前病变机制的研究提供手段.
【关键词】 突变型p53基因；LMP1基因；鼻咽癌前病变；转基因小鼠
0引言
鼻咽癌（NPC）是我国南方常见的一种恶性肿瘤，在我国南方如广东、广西、福建、湖南等省，发病率居世界首位. 在病上鼻咽癌表现为低分化，而临床上则表现为高转移性，其病因、发病机制尚不十分明了. 目前对鼻咽癌的预防效果不太理想，故将鼻咽组织癌变的早期诊断作为鼻咽癌二级预防的主要内容具有重大意义. 缺少合适的动物模型是鼻咽癌前病变研究的主要障碍，利用基因工程技术复制鼻咽癌前病变动物可为探讨鼻咽癌前病变的机制和寻找鼻咽癌前病变的防治方法提供较理想的模型.
1材料和方法
1.1材料
双基因真核表达质粒pLMP1p53mt由本研究组在前期工作中构建［1］，包括载体pLXSN，受human cytomegalovirus启动子（PCMV）控制的p53mt基因和受EDL2启动子（PEDL2）控制的LMP1基因（图1）. 小鼠供体、受体皆为F1杂交鼠（C57BL/6J雌×CBA雄），假孕雌鼠3 mo龄，结扎雄鼠6 mo龄，上海南方模式生物研究中心繁殖，饲养于SPF级动物房.
限制性内切酶SpeⅠ(大连宝生物工程有限公司)；孕马血清促性腺激素(PMSG) (天津实验动物中心); 人绒毛膜促性腺激素(HCG) (上海生化制药厂)；M2，M16胚胎培养液、透明质酸酶及矿物油（Sigma公司）； PCR试剂盒（Promega公司）；小量质粒DNA抽提试剂盒（Plasmid Mini Kit tip 20）、凝胶纯化QIAGEN试剂盒（德国QIAGEN公司）；地高辛标记试剂盒、p53mt多克隆抗体和免疫组化检测试剂盒（博士德公司）；LMP1 mAb (美国Vector公司)；其他常规试剂均为国产分析纯试剂. 用Olympus倒置显微镜和体视显微镜，显微注射系统及制针设备（日本Narishige）、胚胎培养器皿（Falcon 3037，3003）、显微注射用针自制、紫外凝胶成像系统（美国BioRad公司）、紫外分光光度计（岛津，日本）、PCR扩增仪（PE公司）、高速冷冻离心机（Sigma公司）、CO2孵箱（BINDER）、超净工作台（苏净集团安泰公司）.
应用PCGENE软件包根据注射线性载体序列资料自行设计，共选取2对引物用于转基因阳性鼠鉴定，由上海生工生物工程技术公司和上海申友生物技术公司合成. 引物1用于PCR检测转基因动物体内的p53mt基因，上游序列为：5′CAAGATGTTTTACCAACTGGCC3′，含p53基因的突变位点，下游序列为：5′CAGCTCGTGGTGAGGCTCC3′，产物为504 bp. 引物2检测LMP1基因的整合，上游序列为：5′CGGAATTCATGGCGGCGGTGATCCACA3′，下游序列为：5′GATAGGATCCCTCGAGAGTGAGGCACA3′，扩增目的条带为782 bp.
1.2方法
1.2.1注射用双基因真核表达质粒DNA的制备转基因质粒经SpeⅠ酶切成线性，用凝胶纯化QIAGEN试剂盒回收目的片段. DNA溶解在显微注射缓冲液，其终浓度为1.7 mg/L.
1.2.2转基因小鼠的制备雄鼠输精管的结扎、供体鼠的超排卵及交配、假孕母鼠的准备、受精卵的采集、显微注射及移植等均［2］. 转基因被注射入C57BL/6J(雌)与CBA（雄）的杂交一代受精卵雄性原核，然后，移植入假孕母鼠输卵管. 受体鼠怀孕产出仔小鼠.
1.2.3转基因首建鼠的筛选①鼠尾基因组DNA的提取： 剪取出生3 wk的小鼠尾尖1.0~1.5 cm，加入0.7 mL的消化裂解液和35 μL (10 g/L)的蛋白酶，充分混匀，于55℃摇荡过夜；加入0.7 mL苯酚溶液，用等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提1次. 室温蒸发乙醇，加入0.2 mL TE 4℃过夜，溶解DNA. ②PCR检测： 取0.5 μL DNA为模板，PCR检测基因的整合. 反应体系：10×反应缓冲液3.0 μL，MgCl2 1.5 μL，模板DNA 0.5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，dNTPs 1 μL，Taq酶0.5 μL，双蒸水21.5 μL，总量30 μL. 利用引物1检测p53mt基因时，［3］，反应条件：94℃ 4 min，97℃ 40 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，35个循环；72℃ 8 min，扩增目的条带为504 bp；引物2检测LMP1基因整合时，反应条件：94℃ 4 min，94℃ 30 s，72℃ 50 s，35个循环，72℃ 8 min，扩增目的条带为782 bp，10 g/L琼脂糖凝胶电泳观察结果. ③小鼠基因组DNA的Southern blot检测： 取PCR阳性的小鼠基因组DNA 20 μg，以同种普通小鼠基因组DNA及注射用外源基因作为阴性对照和阳性对照，以内切酶BamH I充分消化，8 g/L琼脂糖凝胶电泳后转移至尼龙膜. DNA杂交：以EDL2为探针，按照“DNA随机引物标记试剂盒”所述方法以地高辛标记探针. 信号检测：参照地高辛检测试剂盒的方法进行.
1.2.4病理组织学Southern杂交阳性的转基因小鼠注射250 g/L乌拉坦麻醉后，取鼻腔黏膜、鼻咽组织、肺、食管、胃、大肠、肝、肾、脾组织于40 g/L多聚甲醛中固定24 h以上，进行脱水，透明，石蜡包埋，切片，切片厚4 μm，HE染色，光学显微镜下阅片，观察病理变化.
2结果
2.1DNA显微注射注射片段回收后，用注射用TE稀释至1.7 mg/L，在显微注射仪下将该片段导入小鼠受精卵的雄性原核中. 共注射了707枚受精卵，将其移植入30只假孕母鼠的输卵管中，其中26只母鼠怀孕，移植成功率为86.67%；共出生子代鼠179只.
2.2PCR检测利用PCR从中筛选出9只携带p53mt基因（图2）的小鼠（3只雌性，6只雄性），分别为19号，44号，63号，73号，74号，99号，103号，131号，133号，同时用LMP1基因引物扩增也为阳性（图3），阳性率为5.03%. 这些转基因小鼠不是同一批检测.
2.3Southern杂交检测将PCR阳性的LMP1p53mt首建鼠尾DNA进行Southern blot检测，确证9只小鼠均为阳性（图4）.
2.4病转基因小鼠鼻腔黏膜、鼻咽组织、肺、食管、胃、大肠、肝、肾、脾组织HE染色观察，鼻腔黏膜、鼻咽、食管等出现炎症，鼻腔黏膜有中性粒细胞浸润；鼻咽组织也有中性粒细胞浸润，并且表现出黏膜上皮灶性增生；食管出现中性粒细胞浸润及淋巴细胞浸润（图5）. 其他部位未出现明显病变.
3讨论
野生型p53基因参与细胞周期的调控，阻止细胞从G1期进入S期；对细胞分裂和增殖起负调节作用，同时还能够诱导细胞出现凋亡，被认为似“分子警察”那样监视着细胞DNA的完整性. 突变型p53基因不但丧失了抑癌活性，反而具有促进恶性转化的功能，导入突变型p53基因小鼠为高度肿瘤易感性，约有20%小鼠诱发肿瘤.
LMP1是EBV基因组编码并在鼻咽癌组织中表达的与细胞转化有关的少数几个蛋白质之一，在EBV致癌过程中起重要作用. 现已建立的EBV相关转基因动物模型主要以LMPl为研究对象. LMP1转基因小鼠可诱发B淋巴细胞瘤［4］，但未见鼻咽癌发生的报道，转基因鼠的鼻咽组织中亦未检测到LMP1的表达，于是学者们把目光投向鼻咽组织特异性启动子的研究上.
EDL2启动子存在于EBVBNLF1基因的下游，Nakagawa等［5-6］用该启动子与周期蛋白D1 cDNA的融合基因建立转基因小鼠，在转基因小鼠的舌、食道、前胃及皮肤等组织中检测到周期蛋白D1的表达，且多位于基底层或基底上层复鳞上皮. 体外研究也显示在鳞状上皮细胞系TE11（食道鳞癌细胞系）、SCC13（人皮肤鳞癌细胞系）、SCC25（舌鳞癌细胞系）中EDL2有很高的活性，证实其为鳞状上皮特异性启动子［7］. 杨玉芳等［8］将该启动子导入了小鼠. 张玲等［9］采用受EDL2, PLUNCp双启动子调控鼻咽癌来源的LMP1的表达载体，构建转基因小鼠，在转基因小鼠的鼻咽、前胃、舌根等部位检测到了外源基因的表达，但是未观察到鼻咽组织明显的病理改变，推测可能由于转基因表达时间较短（4 mo）.
本研究利用可调控基因在鼻咽组织表达的相对特异性启动子构建人突变型p53基因和LMP1基因的鼻咽癌前病变小鼠模型. 转基因小鼠检测结果表明在所获得的179只首建转基因小鼠中，9只PCR阳性，再经Southern杂交鉴定，未发现有假阳性. 早期的转基因研究中，一直将Southern杂交作为阳性鼠的最终结论. 实践证明，通过严谨、合理的设计，PCR鉴定完全可以作为最终结论.
对其中一只雄性首建鼠（4 mo龄）进行病理组织学检查，其鼻腔黏膜、鼻咽、食管等表现出炎症，鼻腔黏膜有中性粒细胞浸润；鼻咽组织也有中性粒细胞浸润，并且表现出黏膜上皮灶性增生；食管出现中性粒细胞浸润及淋巴细胞浸润. 其他部位未出现明显病变. 说明EDL2相对特异性启动子控制LMP1基因的表达以及p53mt基因的共同作用，能获得鼻咽癌前病变的动物模型.
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［9］ 张玲，蓝轲，姚开泰，等. 用鼻咽相对特异性调控区建立NLMP1转基因小鼠［J］. 生物化学与生物物理学报，2003,35（12）：1072-1076.
