兔蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛诱导海马组织p38 MAPK磷酸化

【关键词】  脑血管痉挛

　　Phosphorylation of p38MAPK in rabbit hippocampus during cerebral vasospasm following experimental subarachnoid hemorrhage

　　【Abstract】 AIM:  To observe the temporal changes of p38 MAPK and its phosphorylation status in hippocampus after cerebral vasospasm (CVS) following subarachnoid hemorrhage (SAH) and to investigate the molecular mechanisms of brain injury induced by CVS. METHODS:  Western blot was used to detect the changes in the expression p38 MAPK and phosphorylated p38 MAPK (pp38 MAPK) protein in rabbit hippocampus during CVS following experimental SAH. RESULTS:  The expression level of p38 MAPK protein in hippocampus kept unchanged after SAH. But the expression of pp38 MAPK protein increased in hippocampus 1 day after injury, reached the peak at day 4 and remained relatively high level at day 7, which was significantly higher than those in the normal control group (P<001). CONCLUSION:  The present results suggest that the activation of p38 MAPK signal pathway may closely related to the CVSinduced hippocampus injury following SAH.

　　【Keywords】 subarachnoid hemorrhage; cerebral vasospasm; p38 MAPK; blotting,western ; hippocampus

　　【摘要】 目的: 观察蛛网膜下腔出血（SAH）后脑血管痉挛（CVS）模型中海马组织内p38 MAPK及其磷酸化的时相变化特点，初步探讨CVS导致缺血性脑损伤的分子机制. 方法: 用Western blot方法检测兔SAH后CVS时海马组织内p38 MAPK和磷酸化p38 MAPK (pp38 MAPK)蛋白的表达变化.结果: p38 MAPK在SAH组各时间点的海马组织内的表达保持相对恒定，与正常对照组相比无明显变化（P > 005）.pp38 MAPK的表达水平在SAH组1 d时即有明显升高，4 d时达到高峰，7 d时仍维持较高的表达水平，与正常对照组相比有显著差异（P < 001），分别是其在正常组海马组织中表达水平的31，79和62倍.结论: p38 MAPK信号通路的激活可能与SAH后CVS所造成的海马神经元的损伤有密切关系.

　　【关键词】 蛛网膜下腔出血；脑血管痉挛；p38 MAPK；印迹法，海马

　　0引言

　　丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）途径是细胞外信号引起细胞核反应的共同通路.p38 MAPK是MAPK家族的3个主要成员之一，多种细胞外刺激如应激、细胞因子以及G蛋白偶联受体的激活等均可导致p38 MAPK的磷酸化，从而激活p38 MAPK信号通路［1, 2］.在神经系统p38 MAPK存在于大脑皮质、海马、小脑及脑干等脑区的神经核团，参与神经系统不同区域的生理功能［3］.有研究表明，p38 MAPK通路与包括脑缺血、缺氧等多种因素所导致的脑损伤有密切关系.我们采用兔枕大池2次注血法建立脑血管痉挛（cerebral vasospasm,CVS）动物模型［4, 5］，模拟临床上蛛网膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage,SAH）所致的CVS，利用Western blot技术，动态观察了海马组织内p38 MAPK蛋白的表达以及其磷酸化的时相变化，以探讨SAH后CVS导致缺血性脑损伤中p38 MAPK的作用，为临床上有效防治CVS引起的脑损伤提供依据.

　　1材料和方法

　　11材料新西兰白兔12只，雌雄不拘，体质量26～32 kg，由本校实验动物中心提供.小鼠抗p38 MAPK积小鼠抗磷酸化p38 MAPK (pp38 MAPK)单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司；山羊抗βactin多克隆抗体购自美国Chemicon公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗小鼠或山羊二抗购自Chemicon公司；ECL化学发光试剂盒、PVDF膜及Hyperfilm胶片购自美国Amersham公司；蛋白质提取及浓度测定试剂盒购于美国BioRad公司.

　　12兔SAH后CVS兔模型的建立兔随机分成两组： SAH组（n = 9）和正常对照组（n = 3）.SAH组动物im速眠新（846合剂），02 ～ 03 mL/kg，监测血压、呼吸及心率.将兔固定于操作台上，枕部剃毛，常规碘酒、乙醇消毒、铺巾.于枕部中线作一直切口，长25 cm，切口正中为寰枕交界部.锐性分离直达寰枕筋膜.使兔下颏内收，充分显露寰枕部，用18 G套管针与躯体成角约30℃穿刺枕大池，进针约1 cm，体会到突破感后，退出针芯，此时可见清亮脑脊液（CSF）流出.取股动脉的非抗凝血25 mL，缓慢注入枕大池内.退出套管针，局部压迫后，缝合切口.然后取侧卧位，头低30℃放置30 min.首次注血后48 h，由兔耳中央动脉取血25 mL，按上述方法，再次注入枕大池内.此日作为SAH后第0日，动物分别存活1，4，7 d（n = 3/时间点）.正常对照组动物在麻醉后仅做枕部切口，然后缝合伤口.

　　13海马内p38MAPK和pp38MAPK的检测

　　131海马组织蛋白质的提取正常对照组动物及SAH后第1，4，7日的动物在速眠新麻醉下，打开颅腔，快速取脑，分离海马组织，液氮保存.取海马组织加入裂解缓冲液（015 mol/L NaCl，005 mol/L Tris，01 mg/L SDS，01 mg/L苯甲磺酰氟，1 μg/L抑蛋白酶肽，1 mg/L  NP40）.匀浆，冰上裂解30 min，4℃ 12 000 g离心20 min，吸上清，-70℃保存.

　　132蛋白质SDSPAGE及电转印用蛋白定量试剂盒测定蛋白质浓度，取30 μg蛋白，进行125 g/L的聚丙烯酰胺凝胶电泳.电泳结束后，用BioRad半干电转移装置将蛋白质转印至PVDF膜，用含50 mg/L脱脂奶粉的PBST溶液（02 mmol/L PBS，002 g/L吐温20）封闭，室温2 h.

　　133Western blot检测分别加入p38 MAPK（1∶2000）,pp38 MAPK（1∶2500）和βactin（1∶5000）抗体，室温过夜.PBST洗膜，10 min×3次，再加入HRP结合的羊抗小鼠IgG（1∶5000）或驴抗山羊IgG（1∶5000），室温孵育2 h.PBST洗膜后，加入ECL显色剂，置暗室曝光.曝光后的胶片进行显影、定影，用UVP凝胶成像系统对胶片上的条带进行扫描分析.

　　14结果分析用Labworks软件对各阳性条带的密度进行测量，测得的p38 MAPK和pp38 MAPK阳性条带的密度与相应的βactin条带密度的比值作为其蛋白的相对表达量.

　　统计学处理： 采用SPSS101分析软件对实验数据进行方差分析以及两两比较的Dunnet t检验.

　　2结果
　
　　Western blot的结果显示，在正常兔海马组织中检测到了pp38 MAPK，p38MAPK和βactin蛋白的表达，其中p38 MAPK和βactin有较高的表达水平，而pp38 MAPK仅有微弱的表达（Fig 1）.作为内参照的βactin在正常海马组织和SAH后不同时间点的海马组织中的表达水平相当，表明在实验中所加的蛋白量基本一致.p38 MAPK在SAH组各时间点的海马组织内的表达保持相对恒定，与正常对照组相比没有明显变化（P > 005）.pp38 MAPK的表达水平在SAH组1 d时即有明显升高，4 d时达到高峰，7 d时仍维持较高的表达水平，与正常对照组相比有显著差异（P < 001），分别是其在正常组海马组织中表达水平的31，79和62倍（Fig 1,2）.

　　图1正常对照组（N）和SAH组兔海马组织内pp38 MAPK,p38 MAPK和βactin蛋白的表达　略

　　图2兔SAH后CVS海马组织内pp38 MAPK和p38 MAPK蛋白的相对表达水平　略

　　3讨论

　　CVS是 SAH的常见并发症，继发于CVS的脑缺血性损伤具有很大危害性，是患者致残及致死的主要原因之一.近年来对CVS现象已进行了较多的研究，发现CVS的病因是多因素的，氧合血红蛋白、一氧化氮、内皮素、降钙素基因相关肽、血管黏附分子等均参与CVS的发生［6］.但是CVS发生的信号通路机制仍然不清楚.研究SAH后CVS导致的缺血性脑损伤的分子机制，从根本上对其进行的有效防治.以减少SAH的致死或致残率，具有很重要的临床意义.

　　MAPK在许多生长因子、细胞因子和受体激活早期信号转导事件中起关键作用.在受到刺激后，MAPK的苏氨酸和酪氨酸残基被磷酸化，激活它们内在的激酶活性，启动一系列的细胞内信号通路.p38 MAPK是MAPK家族的主要成员之一，参与了神经元分化、存活等生理过程.以往的研究还表明p38 MAPK与脑缺血损伤有密切关系［7, 8］.本实验中，我们观察到SAH组动物海马组织内p38 MAPK的表达在各时间点没有变化，但是pp38 MAPK的表达却在SAH后1 d即明显升高，4 d时达到最高水平，7 d时仍然有很高的水平.上述结果表明在SAH导致CVS后，海马组织内的p38 MAPK被激活，表现为磷酸化水平增高，表明p38 MAPK的活化在SAH后CVS造成缺血性脑损伤中发挥着重要作用.

　　以往的研究表明，海马CA1区神经元对缺血具有选择性敏感，短暂性脑缺血即可导致该区神经元的迟发性死亡.在利用枕大池二次注血法建立的兔脑血管痉挛模型上，最严重的CVS发生在SAH后第 4～7日，此时，海马CA1区正常神经细胞的死亡最为严重 ［5, 9］.本实验中，SAH导致CVS后海马组织内p38 MAPK的磷酸化水平在4～7 d时增高显著，提示p38 MAPK信号通路的激活可能与SAH后CVS造成的海马区神经元的迟发性死亡有关.动物实验的结果进一步表明，p38 MAPK抑制剂SB239063对脑缺血造成的神经元损伤具有保护作用［8］.但是p38 MAPK激活后通过何种机制导致神经元死亡，尚无定论.已经知道，p38 MAPK被磷酸化激活后，可以进一步激活其下游的激酶或多种转录因子，如蛋白激酶MAPK APK2、转录因子ATF2、Elk1等［2, 10］，产生一系列细胞内效应，从而诱导一些特定基因的表达，包括诱导型一氧化氮合酶、选择素、TNFα、IL1β等［11］.这些基因表达产物在脑缺血损伤时的神经细胞凋亡、炎性反应等过程中发挥着重要作用.因此，p38 MAPK参与SAH后CVS造成缺血性脑损伤的机制可能是非常复杂的，对其机制的研究将为临床上从多途径开展对CVS造成的缺血性脑损伤的提供理论依据.

　　【】

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