Ⅰ型胶原基因的克隆及其在正常及年龄相关性白内障晶状体上皮细胞的表达
作者：刘燕 周健 刘新平 药立波 苏景宽 惠延年
【关键词】 胶原
Cloning of collagen typeⅠgene and its expression in lens epithelium in normal and agerelated cataractous people
【Abstract】 AIM : To clone the gene of collagen type Ⅰ, to study its expression in lens epithelium of normal and agerelated cataractous people, and to compare the difference of their expression. METHODS: The collagen type Ⅰ gene was cloned by the improved subtractive hybridization, and the fragment of collagen type Ⅰ cDNA was labeled by digoxin and was hybrided by in situ hybridization on the section of capsule of normal and cataractous lens. RESULTS: Collagen type I gene expressed both in the normal and the agerelated cataractous lens epithelium. The positive cell rate was respectively (73±149)% and (75±163)%, the positive signals index was respectively(060±015) and (073±016) and the expression of the two groups had no significant statistics difference. CONCLUSION: Collagen type Ⅰ gene is expressed in the normal and the agerelated cataractous lens epithelium. There is no significant differences in the expression of collagen type Ⅰ gene in the two groups, indicating that collagen type Ⅰ gene may play an important role in the etiology of cataract and the formation of posterior capsule opacification after cataract surgery.
【Keywords】 collagen;RNA，messenger;cataract; lens;epithelial cells
【摘要】 目的： 克隆Ⅰ型胶原基因并研究其在正常晶状体和年龄相关性白内障晶状体上皮细胞的表达，并比较二者表达的差异.方法： 用改良的消减杂交法克隆Ⅰ型胶原基因，地高辛标记Ⅰ型胶原cDNA片段制作探针，用原位杂交法研究其在晶状体前囊膜切片上的表达，并作统计学处理. 结果： 克隆到了Ⅰ型胶原基因的cDNA片段，长约600 bp，Ⅰ型胶原在正常晶状体和年龄相关性白内障晶状体上皮细胞中均有表达；阳性细胞百分率分别为(730±149)%和(750±163)%，阳性表达的积分指数分别为（060±015）和（073±016），经统计分析，P>005，其在年龄相关性白内障晶体上皮细胞的表达与在正常晶体上皮细胞的表达未见明显差异. 结论： Ⅰ型胶原在正常晶状体和年龄相关性白内障晶状体上皮细胞中均有表达；在年龄相关性白内障晶状体上皮细胞中，其Ⅰ型胶原的表达较正常晶状体未见减少，提示其可能在白内障的发生及白内障术后的后囊混浊中起重要作用.
【关键词】 胶原；RNA，信使；白内障；晶体；上皮细胞；
0引言
在构建年龄相关性白内障差异表达cDNA文库的过程中，我们发现Ⅰ型胶原的cDNA片段存在于该文库中，而Ⅰ型胶原作为广泛存在于人体各组织的物质,又是细胞外基质的4大组成部分之一，Ⅰ型胶原作为一种纤维性胶原，它在细胞的增殖以及组织的疤痕化中起重要作用.晶状体上皮细胞作为晶状体中惟一有分裂活性的细胞，它能分裂分化出晶状体纤维并产生晶体蛋白，能合成基底膜样物质、以及糖胺多糖等细胞外基质，在白内障的发生以及白内障术后晶体后囊混浊中，其作用不可忽视.为进一步证实Ⅰ型胶原在白内障晶体上皮细胞的表达以及其是否存在于正常晶体上皮中，我们直接用临床采集的晶体囊膜标本，用原位杂交方法研究其在正常及白内障晶体囊膜的表达并作了统计学分析，以期为研究白内障的发生以及后发性白内障的形成提供依据.
1材料和方法
11材料皮质性年龄相关性白内障（来自白内障超声乳化术中环形撕囊）10例在第四军医大学西京眼科和兵工眼科医院取材，正常晶状体前囊膜（来自供角膜移植之眼球）10例在西安市第一人民医院眼科和西京医院眼科取材，取材后迅速冻于液氮中，存于-70℃待用. mRNA提取试剂盒（Poly A Tract System 1000）（Promega公司）；Superscript Ⅱ反转录酶（Gibico公司）； Sephacryl S400柱（Promega公司）；链亲和素磁珠（Promega公司）；BiotindUTP（Clontech公司）；KlenTaq LA酶（Clontech公司）；LaTaq酶（TAKARA公司）；地高辛DNA标记和检测试剂盒（德国Roche公司），质粒提取试剂盒（上海华舜生物工程公司），胶回收试剂盒（Gibco公司），琼脂糖和高纯度去离子甲酰胺以及硫酸葡聚糖来自美国Sigma公司，鲑鱼精DNA（Clontech公司），Triton X100 (Sigma公司), 蛋白酶k( Sigma公司),正常山羊血清（武汉博士德公司），50 Denhardts液(由本实验室自配）.引物为随机引物六聚体,在地高辛标记盒内已带.紫外分光光度仪购自美国BECKman公司.
12方法
121Ⅰ型胶原基因的克隆利用改良的消减杂交法，以皮质性年龄相关性白内障组为实验组，以正常晶体囊膜组为扣除组，经过mRNA的提取、反转录、扣除探针的制备、杂交以及目的片段的选择性PCR扩增、cDNA的克隆纯化以及酶切鉴定，从而获得年龄相关性白内障的差异表达cDNA文库.经过对克隆产物的序列分析，获得很多目的片段，其中Ⅰ型胶原的cDNA片段即在其中，片段长600 bp, 构建于质粒载体并保存于DH5α菌种中［1］.
122切片制作将囊膜组织自－７０℃冰箱中取出，置低温恒冷箱切片机中切片，厚度为10 μm，切片贴于经明胶处理的载玻片上，经40 g/L多聚甲醛固定，室温20 min，再用ＰＢＳ冲洗，梯度乙醇脱水各2 min，切片干燥后，置密封盒并加干燥剂存于－70℃，可保存数周.
123探针的标记用Roche公司的地高辛试剂盒标记，将Ⅰ型胶原基因的ｃＤＮＡ菌种从－７０℃取出.经摇菌扩增，用质粒提取试剂盒提取质粒，经10 g/L琼脂糖电泳，切下含ｃＤＮＡ片段的胶块，用胶回收试剂盒回收ｃＤＮＡ.用紫外分光光度仪对ｃＤＮＡ定量，出１ μg的ＤＮＡ量.加随机引物六聚体 1 μL、dNTP 2 μL、klenow酶1 μL,混匀，孵育37℃ 24 h.标记的探针经纯化保存于-20℃.
124 杂交前处理从－７０℃冰箱取出切片，平衡至室温.用ＰＢＳ洗两次，各5 min，02 mol/L甘氨酸孵育切片两次，各5 min.加3 g/L Triton X100，室温孵育15 min.蛋白酶k，37℃孵育30 min.40 g/L多聚甲醛后固定5 min，PBS冲洗后加TEA和乙酸酐使切片乙酰化.用6×SSC洗切片5 min，两次.切片进梯度乙醇脱水干燥，划蜡圈.
125预杂交配含4×SSC和500 g/L去离子甲酰胺的预杂交液，加于切片上.配含500 g/L普通甲酰胺的湿盒液200 mL，加于湿盒底部.切片放湿盒中孵育，37℃，2 h.
126杂交取标记好的探针加入杂交液里，每一组织标本切片加含探针的杂交液25 μL，于37℃杂交16 h.
127杂交后处理取出切片在浓度递减的SSC中洗涤，并使温度递增，以洗去非特异性杂交信号.
128免疫检测切片经洗涤缓冲液摇洗，以及正常羊血清封闭后，加1∶500的羊抗地高辛碱性磷酸酶，于37℃湿盒中孵育2 h.用NBT（nitroblue tetrazolium，硝基蓝四氮唑）、BCIP（5bromo4chloro3indolylphosphate，5溴4氯3吲哚磷酸盐）以及左旋咪唑配制呈色液，于室温在暗室环境下湿盒中呈色12～16 h.用TE终止呈色，二甲苯脱水透明，中性树胶封片.
129结果判定原位杂交完成后，用Olympus显微镜观察，进行细胞形态及阳性颗粒的观察并照相.
由于晶状体囊膜上仅有一层细胞，细胞数量很少，在进行统计时相对较容易.分别取正常及年龄相关性白内障囊膜的原位杂交切片，每张切片计数100个细胞，求出阳性细胞的表达百分率，依据胞质中阳性颗粒（紫蓝色颗粒）的多少及颜色深浅分为强阳性（），阳性（），弱阳性（+），阴性（-），按3，2，1，0分别记数，求出积分指数.积分指数=阳性细胞百分率×强度积分，进行统计学检验.
统计学处理: 采用SPSS 110软件进行统计学分析，所用统计方法为成组t检验.
2结果
21Ⅰ型胶原cDNA片段的酶切鉴定及cDNA的序列分析Ⅰ型胶原的克隆经EcoRⅠ和BamHⅠ酶切，琼脂糖电泳后，得到的片段长约600 bp左右，见Fig 1.
22Ⅰ型胶原基因在人正常及年龄相关性白内障晶状体上皮细胞的表达 经过对原位杂交结果的分析，发现Ⅰ型胶原基因在人正常及在年龄相关性白内障晶状体上皮细胞中均有表达(Fig 2、3）.因囊膜主要为蛋白成分，在原位杂交过程中，因蛋白酶K及其他操作已将其溶解，故HE染色下可见的囊膜在此见不到.低倍镜下见染色的晶状体上皮细胞成线状排列，细胞形态及结构不清.高倍镜下可见杂交阳性信号为棕篮色细小颗粒(箭头所示)，密布于细胞质中，细胞核无染色颗粒.因胞核无染色故在镜下呈空泡状，周围环绕着胞质的棕蓝染色颗粒.背景上亦可见少许棕蓝色颗粒，但与胞质内的密集颗粒差别明显，不影响结果分析.
图1Ⅰ型胶原的cDNA片段的酶切鉴定结果 略
图2Ⅰ型胶原在正常晶状体上皮细胞的表达 略
23Ⅰ型胶原基因表达的阳性细胞百分率与积分指数经统计，正常及白内障组的Ⅰ型胶原基因表达的阳性细胞百分率分别为(730±149)%和(750±163)%，阳性表达的积分指数分别为(060±015)和(073±016)，经统计分析，P>005，其在年龄相关性白内障晶体上皮细胞的表达与在正常晶体上皮细胞的表达未见明显差异.
图3Ⅰ型胶原在人白内障晶状体上皮细胞的表达 略
3讨论
31Ⅰ型胶原cDNA片段本研究所克隆的Ⅰ型胶原cDNA片段，是在建立白内障与正常晶状体上皮细胞差异表达cDNA文库的过程中发现的.而所谓的差异表达文库，是消除了正常组的mRNA而剩余的差异基因，应为白内障组特有而正常组没有或白内障组高表达、正常组低表达的基因.经测序，发现Ⅰ型胶原cDNA片段存在于该文库中，故理论上Ⅰ型胶原基因应为白内障组特有而正常组没有或白内障组高表达而正常组低表达基因.本研究克隆到Ⅰ型胶原cDNA片段，为长600 bp的片段，经与GenBank比较，同源性为999%，可以利用来作为探针，进行进一步的杂交研究.
32Ⅰ型胶原在正常及白内障晶状体上皮的表达Ⅰ型胶原作为一种纤维性胶原，它在细胞的增殖以及组织的疤痕化中起重要作用.有研究发现，前极性白内障的混浊斑块中，存在有Ⅰ型胶原蛋白［2］.晶状体上皮细胞作为晶状体中惟一有分裂活性的细胞，它能分裂分化出晶状体纤维并产生晶体蛋白，能合成基底膜样物质、以及糖胺多糖等细胞外基质，在白内障的发生以及白内障术后晶体后囊混浊中，其作用不可忽视.许多研究证明，体外培养的晶状体上皮细胞具有合成Ⅰ型胶原蛋白的能力［3］；对培养的人晶体上皮细胞的研究，也发现了Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原前mRNA的表达［4］；另外，利用X射线衍射技术和免疫组化技术，有人在牛和人的晶状体囊膜的研究中也发现了Ⅰ型胶原的存在［5、6］，由于晶状体囊膜的成分是由晶状体上皮细胞合成的，故人晶状体上皮可能具有合成Ⅰ型胶原的能力.这些均说明晶体上皮细胞存在Ⅰ型胶原mRNA的表达，具有合成Ⅰ型胶原蛋白的能力.但直接利用人晶状体囊膜标本和原位杂交技术，研究Ⅰ型胶原mRNA在人正常晶状体和年龄相关性白内障晶状体上皮细胞的分布，并比较二者的差异，目前尚未见报道.本研究首次用原位杂交方法证明，Ⅰ型胶原mRNA存在于正常和年龄相关性白内障晶状体上皮的细胞浆中，说明Ⅰ型胶原基因在正常和年龄相关性白内障晶状体上皮细胞中均有表达.其在正常晶状体上皮细胞中的作用可能参与了细胞外基质的形成和晶体囊膜的代谢.
关于Ⅰ型胶原与年龄相关性白内障的关系，目前报道很少.Lee［7］等利用RTPCR技术，发现前极性白内障晶状体上皮细胞中Ⅰ型胶原mRNA高表达，在核性和皮质性白内障中未见差异表达.在前面的实验中本研究曾筛出其为高表达基因，但通过对原位杂交结果的半定量分析，发现Ⅰ型胶原基因在皮质性年龄相关性白内障和正常晶状体上皮细胞中的表达差异并不明显，这与Lee等的研究相吻合.由于实验方法的不同，实验标本之间的误差，造成结果的不一致，其是否参与了年龄相关性白内障的发病，目前仍不能下定论.对Ⅰ型胶原在晶状体上皮的作用及其与年龄相关性白内障发病的关系仍需今后进一步的研究与验证.后发性白内障是影响白内障术后视力提高的重要原因，目前的研究认为，后囊混浊的发生，与白内障术后残留的晶体上皮细胞的移行、增殖与化生有关.Shige［8］等发现，白内障术后由于纤维化引起的后囊混浊中，存在有纤维连接蛋白、Ⅰ型胶原等成分.本研究在白内障以及正常晶状体上皮细胞中均发现有Ⅰ型胶原的表达，且二者表达程度差异不大，说明Ⅰ型胶原在白内障晶体上皮细胞中表达活跃，其对于白内障术后后囊混浊的形成可能起重要作用.但仍缺乏直接证据，有待于今后进一步的研究与验证.
【】
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