TRAIL及其受体与蛛网膜下腔出血后痉挛动脉内皮细胞的凋亡

                           作者;WANG Liang1，GAO GuoDong，ZHAO ZhengWei1，RAO ZhiRen, QIN HuaiZhou, JIA Dong1, SHEN Jing

【关键词】  血管痉挛

　　Role of tumor necrosis factorrelated apoptosisinducing ligand(TRAIL)and its receptors in subarachnoid hemorrhage inducing apoptosis in vasospasm artery endothelial cells

　　1Department of Neurosurgery, Tangdu Hospital, Fourth Military Medical University, Xian 710038, China ,2Department of Neurobiology, School of Basic Medicine,Fourth Military Medical University, Xian 710033, China

　　【Abstract】 AIM: To study the role of tumorrelated apoptosisinducing ligand(TRAIL) and its receporDR4 , receporDR5 in apoptotic endothelial cells of vasospasm artery after subarachnoid hemorrhage.  METHODS: Fiftyfour rabbits were used in the present study. The population was randomly divided into three groups: control group, subarachnoid  hemorrhage(SAH) group and sham operated group and the groups were sacrificed respectively on preoperation and 0, 2, 4 and 7 d (6 per group). The SAH models were made by doublehemorrhage method. Cerebral vasospasm (CVS) was confirmed by angiogram. TRAIL protein and its receptor DR4 ,DR5 expression positive number and apoptotic cell number were determined using immunohistochemical technique and TdTmediated dUTPbiotin nick end labeling (TUNEL). RESULTS: Angiographic vasospasm began on 0 d and peaked on 2 d to 4 d. In TUNEL studies, control rabbits did not demonstrate apoptosis in endothelial cells of the basilar arteries. CVS rabbits beginning on 0 d, apoptosis were noted in endothelial cells(P<001).In immunohistochemical study, TRAIL，DR4 and DR5 expression positive numbers were statistically significant in CVS groups and control groups (P<001). CONCLUSION: TRAIL and its receptor DR4 protein could be related to subarachnoid hemorrhage inducing apoptosis in vasospasm artery endothelial cells. They could be related to the mechanism of postSAH CVS.

　　【Keywords】 subarachnoid hemorrhage；cerebral vasospasm；tumorrelated apoptosisinducing ligand；apoptosis

　　【摘要】目的： 研究肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）及其受体DR4、DR5在实验性蛛网膜下腔出血后痉挛血管内皮细胞表达与凋亡的关系.方法：  54只家兔随机分为3组，对照组（6只），SAH组（24只）和假手术组（24只）.SAH组和假手术组再以时间随机分为4组，0，2，4，7 d组，每组6只.手术前及处死前分别行脑血管造影，评价血管痉挛模型.应用原位缺口末端标记（TUNEL）法显示痉挛血管内皮细胞的凋亡，免疫组化ABC的方法显示TRAIL、DR4、DR5在凋亡的内皮细胞中的表达.结果：  正常对照组基底动脉直径为(070±003) mm，SAH组与正常对照组基底动脉管径比较差异显著（P<001）.痉挛血管内皮细胞的凋亡与对照组相比有显著性差异（P<001），TRAIL及其受体DR4、DR5在内皮细胞中有大量的表达，与对照组有显著性差异（P<001）.结论：   TRAIL及其受体DR4、DR5在蛛网膜下腔出血后痉挛血管内皮细胞的凋亡中有重要意义.TRAIL及其受体DR4和DR5介导的内皮细胞的凋亡在SAH后脑血管痉挛(CVS)的形成机制可能有重要的意义.

　　【关键词】 蛛网膜下腔出血；血管痉挛；肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体；凋亡
　　
　　0引言

　　脑血管痉挛（cerebral vasospasm,CVS）是蛛网膜下腔出血（subarachnoid  hemorrhage,SAH）后最严重的并发症，是患者死亡和致残率增加的最重要原因.目前对SAH后CVS发病的复杂机制尚不十分清楚，也缺乏满意的预防和方法，最近痉挛血管内皮细胞的凋亡［1］在CVS形成中的作用逐渐受到关注.TRAIL（tumorrelated apoptosisinducing ligand,TRAIL）是新发现的TNF超家族成员，它可以通过它的受体DR4和DR5选择性的诱导细胞凋亡［2］，不仅在肿瘤组织的凋亡中发挥重要的作用，而且在某些疾病的病理性损伤修复中也起到一定的作用［3，4］，但是在蛛网膜下腔出血后痉挛血管内皮细胞凋亡的过程中充当的角色还不甚清楚.

　　1材料和方法

　　11材料成年新西兰白兔67只，死亡13只，纳入实验共54只，由本校实验动物中心提供，雌雄不限，体质量24～30 kg，平均27 kg.按动物体质量依次排序，在随机数字表中随机连续取两位数的数字，依序分为3组，对照组6只，脑血管痉挛组24只，假手术组(sham)24只.X线数字减影机(意大利ArcoSi)，Excel14微导管(美国Boston)，Transend微导丝(美国Boston).TUNEL试剂盒，购自Roche公司.TRAIL及其受体DR4、DR5单克隆抗体由第四军医大学免疫学教研室提供.生物素化羊抗鼠二抗购自Sgima公司.

　　12方法

　　121模型的建立试验动物采用枕大池二次注血法建立脑血管痉挛模型.Sham组由生理盐水代替注血.速眠新按02～03 mL/kg麻醉成功后，18G套管针穿刺枕大池，取股动脉非抗凝血25 mL，缓慢注入枕大池中，首次枕大池注血后2 d后依上法再次行枕大池注血，各组动物分别在第1次注血(或注水)前、注血(或注水)后30 min、第2次注血（注水）后30 min，第4日和第7日，行脑血管造影，测量基底动脉直径.

　　122动物的处死与固定动物处死采用全血管灌注方法，麻醉开胸，经心脏灌注，先用生理盐水500 ml冲净血液，然后用预冷的40 g/L多聚甲醛固定液1200 mL灌注，先快注600 mL，继之慢灌600 mL.待固定液滴注完毕，开颅取基底动脉.用40 g/L多聚甲醛后固定2 h，再将所取基底动脉块放入含200 g/L蔗糖磷酸缓冲液，4℃过夜.组织块完全沉底后取组织用冰冻切片机连续轴位切片，片厚12 μm，贴片.

　　123TUNEL法显示细胞凋亡先将切片浸入800 mL/L甲醇和3 mL/L过氧化氢封闭30 min，严格按照ROCHE公司说明书操作.

　　124TRAIL免疫组化染色先将切片10 mol/L PBS漂洗10 min×3次后，浸入800 mL/L甲醇和30 mL/L过氧化氢封闭30 min，再用03 Triton100封闭30 min，同前漂洗之后，用ABC方法进行免疫组化反应，用硫酸镍胺DAB蓝色反应法显色，当阳性产物呈深蓝色而背底无颜色时终止反应.梯度脱水，透明、封片，光镜下观察.

　　13数据处理脑血管造影后以造影时放置于动物颈部的10 mm钢球为参照物，取基底动脉上、中、下3段中点由同一人盲法测量其直径，取其平均值.TUNEL法染色，凋亡细胞计数方法为： 每个样本随机取10个层面计数其阳性细胞数量，以平均值作为各组计数结果.TRAIL及DR4，DR5染色计数与TUNEL法染色计数相同.

　　统计学处理： 各组数据行析因分析，应用SPSS软件进行检验.

　　2结果

　　21 模型制备情况

　　211动物的选入与剔除正常对照组无死亡，sham组在2次注水后，有2只分别于1  d（1只）,4 d(1只)死亡.SAH组首次注血后，2只动物全麻未醒，分别于2,6 h死亡.2只呼吸、心跳聚停；二次注血后3只突然呼吸、心跳停止，另有4只分别于1 d（2只）、2 d（1只）、5 d（1只）死亡，以上13只动物被剔除实验.死亡动物后随机增补动物13只至各组.

　　212动物行为所有动物SAH均有不同程度的行为异常，表现为反应淡漠，食纳差、运动减少、咀嚼不能、毛发杂乱，颈项强直，肢体瘫痪等.大部分动物注血管后出现四肢抽搐，角弓反张，约15～30 s后缓解.动物行为异常以注血当日明显，次日略有缓解，2次注血后症状更为加重，以2～4 d为著.对照组及sham组除死亡动物外，2 d内有轻度的行为异常，3 d后均缓解，如拒食、嗜睡等.

　　213基底动脉管径的测量及模型的大体观察大体标本的对照组与sham组无明显差异，SAH组可见血凝块主要聚积在基底池与基底动脉周围.脑血管造影显示，SAH后血管管径明显变细，远端供血减少（Fig 1）.正常对照组基底动脉直径为(070±003) mm，SAH组与正常对照组基底动脉管径比较差异显著（P<001）；sham组与正常对照组基底动脉管径对比无显著差别(P>005).

　　图1脑血管造影显示枕大池注血前（左）和二次注血后（右）基底动脉直径　略

　　22内皮细胞TUNEL法检测凋亡细胞正常对照组中基底动脉的TUNEL荧光显色中，血管内壁光滑，显色均匀一致，凋亡细胞计数为(032±019)（Fig 2）.SAH组基底动脉内皮皱褶，有不均匀的明显的绿色荧光（Fig 3），与正常对照组基底动脉内皮细胞凋亡数比较，差异非常显著（P<001）；sham组与正常对照组基底动脉内皮细胞凋亡数对比，无显著差异(P>005).

　　图2－图4　略

　　23内皮细胞TRAIL和DR4,DR5表达SAH组基底动脉内皮皱褶屈曲，内皮细胞有大量深黑色浓染的颗粒的阳性细胞表达，与正常对照组中基底动脉TRAIL和DR4,DR5比较,差异非常显著（P<001，Fig 4～7）.

　　图5－图 7　略

　　表1SAH后各组时相点基底动脉直径、TUNEL和TRAIL、DR4、DR5阳性细胞数量　略

　　3讨论

　　TRAIL是新近发现的1种TNF家族成员［5］，它与TNF家族的FasL,TNFα一样可以引起细胞的凋亡.TRAIL是II型跨膜蛋白，诱骗受体,DcR1,DcR2胞内没有死亡机构域，仅表达于正常细胞中，保护细胞不受到TRAIL的凋亡作用［6］.死亡受体DR4,DR5胞内含有由79个氨基酸组成的死亡结构域（death domain, DD）［7］，被激活之后形成异源二聚体，通过胞内的DD与FADD,caspase8的DED区结合，引起caspase家族的级联反应，使CAD活化而导致细胞凋亡.Martin［8］等的发现改变了过去人们认为神经系统不表达TRAIL及其受体的观点，TRAIL在神经系统疾病中的作用逐渐受到重视.

　　CVS是SAH后最为重要的并发症之一.CVS血管平滑肌的坏死早已被公认［9］，但是最近的研究表明血管内皮细胞的凋亡在蛛网膜下腔出血后血管痉挛的机制中有重要的作用.本实验应用经典的枕大池二次注血模型，根据术前术后脑血管造影的结果表明注血后基底动脉明显发生痉挛(P<001)，与人蛛网膜下腔出血后的脑血管痉挛类似.SAH组基底动脉内皮细胞的凋亡进一步验证了前人的研究成果，并且证实基底动脉内皮细胞凋亡与血管痉挛的程度有一定的相关性，那么究竟是什么途径介导了内皮细胞的凋亡，进而促进了CVS的形成就成为一个有待于解决的问题.实验证实［10］Bcl2和Bax，p53，fas等在血管内皮细胞收到痉挛因子刺激后均有大量的表达，同时钙拮抗剂可以有效地阻止和抑制部分凋亡的产生.目前，对于临床上蛛网膜下腔出血的患者预放和脑血管痉挛的有效方法很少，只有钙拮抗剂的预防性应用有一定的临床效果，但是远远不能完全阻止血管痉挛的发生.本实验应用免疫组织化学的方法在家兔的枕大池二次注血模型中发现TRAIL及其死亡受体在痉挛血管的内皮细胞中有大量的表达,表明TRAIL分子及其受体DR4、DR5在痉挛血管内皮细胞的凋亡中有可能充当着重要的作用.那么，不依赖于钙离子通道而引起细胞凋亡的TRAIL及其受体途径在血管痉挛的机制中充当着何种角色，将成为进一步的研究的热点，有可能会为临床预防和治疗CVS提供一定的帮助.

　　【】

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　　［2］ MacFarlane M, Ahmad M, Srinivasula SM, et al. Identification and molecular cloning of two novel receptors for the cytotoxic ligand　TRAIL［J］.  J Biol Chem, 1997;272(41):25417-25420.

　　［3］ Gochuico BR, Zhang J, Ma BY, et al. TRAIL expression in vascular smooth muscle［J］. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2000;278(5):L1045-1050.

　　［4］ 张雅君,王汉民,陈威,等.狼疮肾炎患者血清sTRAIL及其受体DR4升高 ［J］.第四军医大学学报,2003;24 （11）:1040-1041.
Zhang YJ , Wang HM , Chen W,et al. Rising level of serum sTRAIL and its recipient DR4 in patients with lupusnephritis ［J］ . J Fourth Mil Med Univ,2003 ;24(11):1040-1041.
 
　　［5］ Wiley SR, Schooley K, Smolak PJ, et al. Identification and characterization of a new member of the TNF family that induces apoptosis［J］. Immunity,1995 ;3(6):673-682.

　　［6］ 付建芳,姬秋和,黄威权,等.桥本甲状腺炎中TRAIL及其死亡受体DR4,DR5的表达［J］.第四军医大学学报,2002;23(10):920-923.
Fu JF ,Ji QH , Huang EQ, et al . Expression of TRAIL ,DR4 and DR5 in Hashimots thyroiditis ［J］ . J Fourth Mil Med Univ ,2002;23(10) :920 - 923.

　　［7］ Pan G,ORourkr K, Chinnaiyan AM, et al. The receptor for the cytotoxic ligand TRAIL［J］. Science, 1997;276(5309):111-113.

　　［8］ Martin VA, Herr I, Jeremias I, et al. CD95 ligand (Fas-L/APO-1L) and tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand mediate ischemia-induced apoptosis in neurons［J］. J Neurosci, 1999;19(10):3809-3817.

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