P物质对体外培养成骨细胞增殖和活性的影响

【关键词】  骨细胞

　　Effect of substance P on proliferation and activity of osteoblasts in vitro

　　【Abstract】 AIM: To observe the effect of substance P (SP) on the proliferation and activity of osteoblasts cultured in vitro. METHODS:  The calvarium bone of newborn rats was digested with bacterial collagenase and cultured to obtain osteoblasts and SP with different concentrations was then added. The proliferation and activity changes of the osteoblasts were identified by counting the cells, determining the ALP activity and observing the changes of cell cycle. RESULTS:  SP of 1×10-12-1×10-6 mol/L had enhancing effects on the proliferation and activity of osteoblasts, while the concentration of 1×10-8 mol/L had the strongest enhancing effects. CONCLUSION:  SP has enhancing effects on the proliferation and activity of osteoblasts.

　　【Keywords】 substance P; osteoblast; proliferation; activity

　　【摘要】 目的: 观察P物质（substance P，SP）对体外培养的成骨细胞增殖和活性的影响. 方法: 采用新生大鼠颅盖骨消化法培养成骨细胞，再加入不同浓度的SP，观察细胞生长数量，测定碱性磷酸酶活性及观察细胞周期变化. 结果: 浓度范围从1×10-12~1×10-6 mol/L的SP对成骨细胞的增殖和活性都有促进作用，在浓度为1×10-8 mol/L对成骨细胞增殖和活性的促进作用最强. 结论:  SP对成骨细胞增殖和活性有促进作用.

　　【关键词】 P物质；成骨细胞；增殖；活性

　　0引言

　　P物质（substance P，SP）是最早发现的神经肽，已经证实SP神经肽免疫阳性神经纤维的变化贯穿于正畸牙周组织的破坏吸收以及再生修复的整个过程. 并且主要是SP，降钙素基因相关肽（CGRP）参与了牙槽骨的改建. SP主要通过与它的受体Neurokinin1受体（NK1受体）结合发挥调节作用. 但SP在正畸牙槽骨改建过程中有何作用，目前还不十分清楚. 我们通过体外培养大鼠成骨细胞，观察SP对成骨细胞增殖和活性的影响,以期为揭示SP正畸牙槽骨的改建作用和机制提供依据.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　DMEM培养液（Gibco公司），新生牛血清（杭州四季青生物制品公司），MTT（Sigma公司），碱性磷酸酶试剂盒（北京中生北控生物科技股份有限公司），Triton X100（华美公司），SP（Sigma公司），DNAprep Regain Kit（BeckmanCoulter公司）；酶联免疫检测仪（华东管厂），ELITE ESP型流式细胞仪（BeckmanCoulter公司）.

　　1.2方法

　　1.2.1成骨细胞的培养取出生24 h内的SD大鼠（购于第四军医大学实验动物中心）为实验对象，采用颅盖骨消化法培养成骨细胞. 待细胞长满培养瓶壁时传代培养，传至第2代时用差速贴壁法除去成纤维细胞.

　　1.2.2成骨细胞增殖检测―细胞计数法将第3代的成骨细胞用胰蛋白酶消化，用含100 mL/L血清的DMEM培养基稀释成5×107/L的细胞悬液，以每孔1 mL接种于24孔培养板. 培养24 h，然后更换为含有不同浓度SP的培养基继续培养［终浓度为0（对照），1×10-12，1×10-10，1×10-8，1×10-6 mol/L］，每浓度6个平行孔，48 h后消化，计数.

　　1.2.3成骨细胞增殖检测―MTT法将第4代的成骨细胞消化，并稀释成5×107/L的细胞悬液，以每孔200 μL接种于96孔培养板. 培养24 h，然后更换为含有不同浓度的SP培养基继续培养，每浓度6个平行孔,常规MTT法测量，使用酶联免疫检测仪测量A490 nm值.

　　1.2.4成骨细胞碱性磷酸酶(ALP)活性检测细胞处理方法同MTT法，用不同浓度的SP培养基培养,每浓度6个平行孔,常规ALP活性检测法检测，通过酶联免疫仪测量A410 nm值.

　　1.2.5成骨细胞的细胞周期检测将第3代的成骨细胞消化后稀释，每50 mL培养瓶接种5 mL细胞悬液. 培养24 h，然后更换为含有不同浓度SP的培养基继续培养48 h，再次消化，洗涤，固定，4℃过夜. 调整细胞数在1×109/L，各样本加入DNAprep stain染液500 μL，避光染色30 min，用ELITE ESP型流式细胞仪测定DNA含量，并用Multicycle软件分析细胞周期分布情况.
   
　　统计学处理：数据以x±s表示，使用SPSS 10．0 for Windows统计软件处理，其中细胞计数用非参数统计，MTT和ALP用方差分析（ANOVA）统计.

　　2结果
   
　　SP在1×10-10，1×10-8，1×10-6 mol/L时，对细胞计数结果影响较大，与对照组均有显著差异，在1×10-8 mol/L时对MTT计数及ALP活性结果影响最大，其A值与对照组有显著差异(P<0.01, 表1). 当SP在1×10-8 mol/L时，对细胞周期影响最大，S+G2M期细胞数量最多(表2).表1成骨细胞细胞计数、MTT、碱性磷酸酶活性测定(略)表2成骨细胞的细胞周期测定（略）

　　3讨论

　　在人体多种骨组织内分布有SP样神经纤维，包括长骨，关节，牙齿等. 以往的研究证实SP与骨代谢联系密切. 在骨折愈合过程中，发现SP样神经纤维与毛细血管一同出现在新生骨组织的周围；Sandhu等［1］观察到切断交感神经可促进外周SP的释放增加和骨的吸收. 其原因可能为切断交感神经后使得交感神经对所支配骨组织内的神经生长因子的摄入减少，而感觉神经对神经生长因子的摄入增加，神经生长因子的摄入增加将进一步促进感觉神经元内SP的合成和向外周的释放，从而促进骨的吸收. 进一步的研究认为切断交感神经不仅影响骨的吸收同时影响骨的形成. Sandhu等［1］发现切断交感神经增加了外周SP，但减少了股骨干骨膜成骨细胞对［3H］Proline的摄入.

　　在牙周组织中，SP样神经纤维来源于三叉神经节，主要分布在牙周间隙的中分和根尖区沿血管分布. 在正畸牙齿移动过程中，伴随着压力侧牙槽骨的吸收和张力侧牙槽骨的形成，研究发现［2］SP神经纤维在这一过程中发生了明显的反应：正畸加力后1 h反应就开始增强，至撤除外力后14 d其强度和密度仍明显高于对照组. 另有研究发现切断下齿槽神经，明显抑制了正畸牙齿张力侧新骨的形成［3］. 可见SP样神经纤维与正畸牙周组织的改建关系密切.

　　但到目前为止，关于SP影响骨代谢尤其是如何促进成骨细胞成骨的直接证据很少. 有学者［4-7］首先采用免疫组化技术分别在光镜和电镜下观察到成骨细胞、破骨细胞和骨细胞内SP受体的阳性表达. 我们则通过体外培养成骨细胞发现不同浓度SP对成骨细胞的增殖和活性都有促进作用，而在浓度为1×10-8 mol/L对成骨细胞增殖和活性的促进作用最强，对细胞周期的影响也是在这一浓度最大. 这也与孙应明等［8］和Mori等［9］的观察结果相符. 他们通过激光共聚焦扫描技术,观察到体外培养的大鼠成骨细胞在受到SP刺激后,其胞内Ca2+发生了明显的变化.

　　因此推测SP可能直接作用于成骨细胞，与成骨细胞SP受体结合，并进一步激活细胞内第二信使Ca2+，从而发挥对成骨细胞的调节作用. 但正畸牙齿的移动是伴随着压力侧牙槽骨吸收和张力侧牙槽骨形成的复杂过程，牙周感觉神经受到机械刺激释放SP，SP在牙齿移动的哪些阶段、通过那些具体途径来影响成骨细胞，从而参与牙槽骨的改建还需要进一步的研究来阐明.

　　【】

　　［1］ Sandhu HS, Kwong H, Herskovits MS, et al. The early effects of surgical  sympathectomy induced bone resorption in rat incisor socket［J］. Arch Oral Biol, 1990,35(12):1003-1007.

　　［2］ Norevall LI, Forsgren S, Matsson L. Expression of neuropeptides (CGRP, substance P) during and after orthodontic tooth movement in the rat［J］. Eur J Orthod, 1995,17(4):311-325.

　　［3］ Duan YZ, Inoue K, Kawakami M, et al. Changes in bone formation during experimental tooth movement after denervation of the rabbit in ferior alveolar nerve［J］. Osaka Univ Dent Sch，1993,33(1):45-50.

　　［4］ Goto T, Yamaza T, Kido MA, et al. Light and electronmicroscopic study of the distribution of axons containing substance P and the localization of neurokinin1 receptor in bone［J］. Cell Tissue Res, 1998,293(1):87-93.

　　［5］ 孙应明,罗颂椒,赵昱辉. P物质受体在体外培养破骨细胞内的表达及意义［J］. 口腔医学杂志, 2005;25(3):169-171.

　　［6］ Fristad I, VandevskaRadunovic V, Fjied K, et al. NK1, NK2, NK3 and CGRP1 receptors identified in rat oral soft tissues,and in bone and dental hard tissue cells ［J］. Cell Tissue Res, 2003,(311): 383-391.

　　［7］ Fristad I, VandevskaRadunovic V, Hals I, et al. NK1 receptor expression in the mature dental pulp of rats ［J］. Arch Oral Bio, 1999,(44): 191-195.

　　［8］ 孙应明,段银钟,樊成涛. P物质对体外培养成骨细胞内游离钙浓度的影响［J］. 中华口腔医学杂志, 2001， 36(6): 408-411.

　　［9］ Mori T, Ogata T, Okumura H, et al. Substance P regulates the function of rabbit cultured osteoclast: Increase of intracellular free calcim concentration and enhancement of bone resortion［J］. Biochem Biophys Res Commun, 1999,262(2):418-422.