血管细胞黏附分子
作者：陈利萍 刘华 贺永锋 朱新菊 李林 刘新社
【关键词】 血管细胞黏附分子
Role of VCAM1 in the vascular injury of pulmonary fibrosis
【Abstract】 AIM: To explore the expression of vascular cell adhesion molecule1(VCAM1) in pulmonary tissues of rats with bleomycin(BLM)induced pulmonary fibrosis and the role of VCAM1 in vascular injury. METHODS: The immunoreaction of VCAM1 in pulmonary tissues of rats with BLMinduced pulmonary fibrosis was analyzed by immunohistochemical technique and image processing system. RESULTS: The expression of VCAM1 in the lung tissues of normal rats was weak, and distributed mainly in alveolar epithelial cells, bronchiole epithelial cells, alveolar macrophage and some pulmonary interstitium. The expression of VCAM1 in lung tissues of rats with BLM induced pulmonary fibrosis was higher than that in normal rats, with significant difference (P＜0.05). CONCLUSION: VCAM1 is one of the important cell factors in BLMinduced pulmonary fibrosis and it directly participates in the pulmonary inflammation and the process of fibrosis.
【Keywords】 vascular cell adhesion molecule1; pulmonary fibrosis; blood vessels/injuries; immunohistochemistry
【摘要】目的： 探讨血管细胞黏附分子1 (VCAM1)在博莱霉素（BLM）致大鼠肺纤维化肺组织中的表达及其在肺血管损害中的作用. 方法： 采用免疫组化方法结合图像分析处理系统，研究VCAM1在博莱霉素致肺纤维化大鼠肺组织中的免疫反应. 结果： 在正常对照组,VCAM1大鼠肺组织中呈弱表达，分布于肺泡上皮细胞、细支气管上皮细胞、肺泡巨噬细胞及少量的肺内间质. 在实验组,VCAM1亦表达于上述细胞并呈高表达，两者差异有统计学意义(P0.05). 结论： 在博莱霉素致大鼠肺损伤中VCAM1是肺血管损害的重要细胞因子之一，它参与了肺组织炎症和纤维化过程.
【关键词】 血管细胞黏附分子1；肺纤维化；血管/损伤；免疫组织化学
0引言
肺间质纤维化是以运动性呼吸困难为主要特征的一组病变. 有关肺纤维化发生的机制已有了较深入的研究，但有关肺间质病时肺内组织、血管的损伤机制尚不清楚. 研究证明血管内皮损伤与白细胞激活有重要关系，而白细胞的激活是由表达于白细胞和内皮细胞表面的黏附分子所调节［1-2］. 血管细胞间黏附分子1(vascular cell adhesion molecule1,VCAM1)作为介导白细胞与血管内皮细胞黏附的重要因子在血管损伤中起重要作用. 我们采用形态学研究方法及免疫组织化学方法对肺间质病变中VCAM1的表达与组织血管损害后果之间的关系进行研究，以探讨肺间质病的发生与细胞因子及炎症介质之间的关联.
1材料和方法
1.1材料健康雌性Wistar大鼠60只(西安大学医学院实验动物中心)， 体质量200～250 g，博莱霉素（BLM，日本株式会社）；戊巴比妥钠（国药集团化学试剂有限公司）；VCAM1免疫组化试剂盒（武汉Boster公司）；图像分析系统（北京航空彩色病理图像分析系统）.
1.2方法
1.2.1肺纤维化动物模型的建立将60只动物随机分为 BLM组和生理盐水(NS)对照组，每组各30只. BLM组用戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，在无菌操作下作颈部正中切口，逐层暴露气管，用前带7号针头的l mL注射器抽取生理盐水0.2～0.3 mL(含BLM 5 mg/kg). 经两气管软骨环间隙朝向心端刺入气管，将大鼠直立，继续朝向心端进针约1.0～1.5 cm，回抽出空气并无阻力后将药液注入气管，旋转动物使药液在肺内分布充分、均匀. 在同样条件下，向NS组动物气管内注入相同体积的NS. 两组动物分别于气管内灌注后3, 7, 14， 21, 28 d随机处死动物各6只.
1.2.2肺组织病理标本的制作用戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠. 常规消毒后开胸，暴露心肺，于右心室插入与输液器相连的针,左心耳剪一长约2 mm的切口,经输液器向右心室内灌注PBS(pH 7.4)冲洗血管床至双肺呈白色胶冻状. 结扎左主支气管，经气管向右肺注入40 g/L多聚甲醛6 mL，使胸膜展开，结扎气管后右肺置40 g/L多聚甲醛中固定. 在右肺上、中、下叶各取材一块，常规脱水，石蜡包埋、 5 μm切片.
1.2.3肺组织VCAM1表达的测定采用免疫组化SABC法,用PBS代替一抗作空白对照. 主要步骤如下:常规脱蜡水化；30 mL/L过氧化氢去除内源性过氧化物酶；正常血清封闭；加一抗（1∶150）4℃过夜；加入生物素化二抗2 h，DAB显色15 min，苏木素复染，经脱水、透明和封片后光镜观察.
1.2.4肺组织VCAM1表达的定量使用北京航空彩色病理图像分析系统，将待测切片放置在连接机的显微镜下观察. 每组6只动物,每只动物取3张组织切片,每张切片取5个视野,即计算每一标本上、中、下、左、右5个视野(高倍×400)VCAM1平均A值.
统计学处理： 采用SPSS12.0统计分析软件，进行t检验和相关分析.
2结果
2.1肺组织病理变化大体标本示NS组双肺呈粉红色，表面光滑,开胸后迅速萎陷；BLM组可见双肺表面灶状分布的出血点，随时间延长上述改变由新鲜变为陈旧，肺表面可见点状、索条状淡黄色凹陷,开胸后肺组织萎陷不明显. 光镜下NS组各观察点均无明显改变. BLM组第3日可见肺泡壁水肿，炎性细胞渗出增多. 第7日时炎症更明显(图1)，为大片状炎性细胞浸润，成纤维细胞增多. 第14日时肺泡炎仍较重，成纤维细胞进一步增多. 第21～28日部分肺泡结构消失，局灶性纤维化和纤维结节形成，炎性细胞渗出有所减少.
2.2VCAM1在肺组织的分布抗原修复后的免疫组化表明，NS组大鼠肺组织VCAM1在肺微血管内皮细胞、肺泡上皮细胞、细支气管上皮细胞及炎性细胞呈弱表达. BLM组气管内灌注后大鼠肺泡上皮细胞、炎性细胞、肺血管内皮细胞、支气管黏膜上皮细胞VCAM1表达明显增强(图2).
图1－图2 略
2.3肺组织VCAM1的定量表达 肺泡上皮、血管内皮VCAM1表达于气管内灌注BLM后第3日即开始增高，第7日达高峰，第28日仍与对照组差异有统计学意义(P<0.05，表1).
表1对照组与博莱霉素（BLM）组VCAM表达水平的对比(略)
3讨论
有关肺纤维化发生的机制已有深入的研究,但有关肺间质病时肺内组织、血管的损伤机制尚不清楚. 研究证明血管内皮损伤与白细胞激活有重要关系［1］，而白细胞的激活是由表达于白细胞和内皮细胞表面的黏附分子所调节［2］. 已发现的黏附分子主要有5类:免疫球蛋白超家族、整合素家族、选择素家族、钙黏素家族和其他未分类的黏附分子. VCAM1属于免疫球蛋白超家族,介导细胞与细胞以及细胞与细胞外基质之间的黏附. 在静息状态下不表达,主要表达在细胞因子活化的血管内皮细胞表面,介导淋巴细胞和白细胞与血管内皮细胞的黏附作用［3］. 在炎症等病理情况下,VCAM1分子数量和功能可明显上调,参与组织损伤［4］. 已经证明 T淋巴细胞可以通过VLA4(CD49)VCAM1机制与血管内皮细胞黏附结合［5］，引起血管内皮损伤. 有报道感染性心内膜炎早期，VCAM1在左心系统和右心系统有着不同的分布和变化特点［6］. Charpin等［7］研究发现乳癌组织与正常乳腺组织相比,VCAM1呈过度表达,并认为VCAM1与其配体VLA4的结合激活了组织中血管内皮细胞,促使了肿瘤的转移. Koch等［8］发现细胞黏附与血管生成间存在联系,VCAM1与配体VLA4相互作用,对内皮细胞产生直接的血管生成效应,从而促进肿瘤微血管的生成,为肿瘤转移提供条件. 国内已有研究［9-10］显示妊高征患者胎盘组织中毛细血管内皮细胞上VCAM1的表达增强,绒毛滋养细胞的表达减弱.
引起肺间质纤维化的原因很多，但其病程早期均有肺泡炎表现,这种肺泡炎改变是损伤因子直接或间接导致肺泡壁毛细血管内皮通透性增高甚至肺组织结构的破坏. 已有研究证实： BLM感染3 d时即可观察到大鼠肺泡壁基底膜水肿、裸露、断裂，血管内皮细胞受损［11］. 本组实验结果显示, 在BLM给药后第3日可见肺泡血管内皮细胞、上皮细胞VCAM1表达即升高,第7日时VCAM1免疫阳性反应达到高峰,其后略有下降,至28 d（日）仍有较高水平的表达. VCAM1与白细胞表面的VLA4结合，使白细胞黏附在内皮细胞表面，引起白细胞活化，释放多种颗粒物质，破坏内皮细胞基底膜使膜脂质过氧化、细胞溶解，导致血管内皮渗透性增加［12］. 因此认为VCAM1在肺血管内皮细胞表达，促进炎性细胞与血管内皮的黏附,导致血管内皮渗透性增加，介导其跨内皮转移并渗出至肺组织,激发肺泡炎的病理过程. 在给药14 d后VCAM1水平有所下降，但仍高于对照组水平，表明组织修复过程已经启动，一些细胞因子参与了内皮细胞的修复，限制了损伤的进一步加重. 由于在肺纤维化早期肺泡炎阶段,VCAM1在血管内皮细胞及肺泡上皮的表达增加,并证明其参与了肺组织炎症的血管损害,因此,血管细胞黏附分子是肺血管损害重要的细胞因子之一，它参与了肺组织炎症和纤维化过程.
我们通过对VCAM1表达水平的检测，从血管损伤方面进一步阐述了肺间质纤维化的发生机制. 同时也提示我们在临床方面，应该采用对血管损伤有保护作用的药物，早期治疗可能取得更好的结果.
【】
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