中药泽黄颗粒对糖尿病大鼠肺组织水通道蛋白

                                     作者：李敏，李锋，胡波，李军昌，张雅萍，王汉民，张三奇

【关键词】  糖尿病；肺/损伤；水孔蛋白类；泽黄颗粒

　　Effect of ZeHuangKeLi on aquaporin1 expression in lung tissues in diabetic rats

　　【Abstract】 AIM： To study the expression and activity of aquaporin1 (AQP1) in pulmonary tissues in diabetic rats after fed ZeHuangKeLi (ZHKL). METHODS： In 60 SD rats, diabetes mellitus (DM) was induced by highglucose and highlipid diet and intraperitoneal injection of streptozotocin (STZ). After 2 months, DM rats were chosen and randomly divided into model group, observed group, control group (10 rats per group).After 2 monthtreatment of ZHKL, we observed the pathologic changes in lungs and detected the expression AQP1 by immunohistochemistry.  RESULTS： We observed the thickened basal lamina of pulmonary capillary and increased number of fibres in DM rats. The expression of AQP1 decreased in the model group. Compared with the model and control groups, the expression of AQP1 increased in the observed group (P<0.05). CONCLUSION： AQP1  is decreased in lung tissues  in  DMinduced   microcirculation disorder.  AQP1 plays an important role in lung edema in DM rats. ZHKL can regulate the activity of AQP1 to improve the water metabolism of lung tissue.

　　【Keywords】 diabetes mellitus; lung/injuries; aquaporins;  ZeHuangKeLi

　　【摘要】 目的： 研究中药泽黄颗粒对糖尿病（DM）大鼠肺组织水通道蛋白1（AQP1）表达的影响. 方法： SD大鼠60只，高糖高脂饲料喂养并用链脲佐菌素（STZ）腹腔注射制作DM大鼠模型,2 mo后挑选成模大鼠随机分到模型组、观察组、对照组，每组10只.  给药2 mo后观察肺组织的病理改变并用免疫组化方法检测DM大鼠肺组织AQP1的表达. 结果： DM大鼠肺泡间隔及毛细血管壁增厚，模型组肺组织AQP1表达下降，观察组较模型组和对照组表达升高（P<0.05）.  结论： DM时大鼠肺组织微循环障碍,AQP1表达下降，提示AQP1参与DM肺水肿的发生，泽黄颗粒可调节AQP1表达水平，改善肺组织病理改变.

　　【关键词】 糖尿病；肺/损伤；水孔蛋白类；泽黄颗粒
 
　　0引言

　　糖尿病(diabetes mellitus, DM)可引起脏器的慢性损害和功能异常，主要病理改变为微血管病变. 对DM引起肺微血管损害主要是肺脏明显肿胀，组织间大量液体聚集［1］，水通道蛋白家族（AQPs）在DM引起微血管并发症发生发展中起重要作用［2］.  我们研究的目的是观察中药泽黄颗粒(ZHKL）在DM肺组织微血管的病改变中的作用和对水通道蛋白1(AQP1)表达的影响.
 
　　1材料和方法

　　1.1材料4周龄雄性SPF级SD大鼠［第四军医大学实验动物中心提供，医动证字SC×K(军)2006001］60只, 体质量(165±12) g. SPF级饲养环境，环境温度为2O～25℃，12/12  h昼夜，按每笼5只喂养. 随机分为DM模型组（模型组），ZHKL观察组（观察组），美吡达对照组（对照组）3组.

　　AQP1兔抗鼠多克隆抗体购自美国Chemicon（AB3272）；辣根过氧化物酶标记的二抗(羊抗兔，北京中杉公司）；链脲佐菌素(Streptozotocin，STZ，Sigma公司)；ZHKL（丹参、泽兰、黄芪等）西京药剂科中药制剂室煎制，浓缩成稠膏后，4℃储藏备用；美吡达片（购自上海第十五制药厂）.

　　1.2方法

　　1.2.1造模和给药将60只大鼠同时给予进食高胆固醇、高糖混合饲料，即普通饲料中加入100 g/L猪油、100 g/L葡萄糖、10 g/L胆固醇、20 g/L蛋黄粉、2 g/L胆酸钠. 各组大鼠在高糖高脂饲料喂养4 wk后尾静脉注射低剂量STZ(30 mg/kg)1次. 注射1 mo后测定各组大鼠血糖值和尿糖. 挑选血糖值高于7.8 mmol/L，尿糖阳性者为DM大鼠，共选出DM大鼠30只（成模率50%）. 随机将30只DM大鼠分为模型组、观察组、对照组中，每组10只. 观察组动物给予ZHKL稠膏（浓缩后克含生药0.0051 g），按每日5.5 g/kg 1次灌胃（灌胃剂量按大鼠用药剂量为人的10倍）. 对照组动物给予美吡达（搅碎后蒸馏水溶解，配成0.5 g/L 浓度），按5 mg/kg 剂量每日1次灌胃；模型组动物同时给予等剂量生理盐水灌胃. 实验期间，所有动物在同一条件下，室温保持在20～24℃，相对湿度40%. 模型组、组、观察组动物继续给予高糖高脂饮食，自由饮水.
 
　　1.2.2取材至16 wk时，各组大鼠禁食16 h，不禁水后，以250 g/L乌拉坦(4 mL/kg)腹腔麻醉后腹主动脉取血8 mL，加入肝素锂抗凝管中于4 h内检测血糖、血肌酐、尿素氮. 开胸充分暴露手术视野，分离肺组织，将肺组织迅速放入装有40 g/L甲醛的瓶中固定. 右肺中、下叶做病理学观察，左肺做免疫组化染色(48～72 h后逐级脱水,常温石蜡包埋,切片，苏木精伊红染色,光镜下观察).

　　1.2.3AQP1免疫组化用PBS液冲洗玻片标本3×3 min. 随后用1∶40的300 mL/L H2O2. PBS 37℃ 30 min. PBS液冲洗3×3 min. 用含TritonX的小牛血清封闭特异部位37℃  30 min. PBS液冲洗3×3 min. 样品片加1∶50兔抗鼠AQP1抗体50 μL 37℃下密封孵育30 min. PBS液冲洗3×3 min . 加辣根过氧化酶标记的羊抗兔IgG 50 μL在37℃ 下孵育30 min. PBS液冲洗3×3 min. 加ABC酶在37℃下静置 30 min. PBS液冲洗3×3 min. 硫酸镍胺醋酸缓冲液50 mL和50 mL蒸馏水溶解DAB 15 mg过滤后的溶液混合，加入葡萄糖200 mg，氯化胺40 mg，最后放入葡萄糖氧化酶1 mg混匀. 20～30 min显色. 最后用蒸馏水冲洗3次玻片，存片，观察拍照. 对照片第一抗体用PBS液代替,其他步骤同样品片. 肺泡间质中微血管呈现棕黄色为阳性，所有切片放大倍数为400. 每组随机取5只动物，每只动物AQP1染色各取3张切片，各观察10个视野，面积为480 000 mm2，免疫组化结果以单个视野下阳性微血管数表示.
　　
　　统计学处理：所有定量资料均采用x±s表示,应用SPSS10.0统计软件进行单因素方差分析,多个样本均数间两两比较采用SNKq检验.

 　　2结果

　　2.1大体观察模型组大鼠精神萎靡、倦怠懒散，体臭难闻，均出现多饮、多食、多尿(“三多一少”)症状，早期体质量不同程度地有所增加，8 wk后体质量下降，消瘦，挠痒，毛发粗糙坚硬，尾部发黑、有脱皮现象；后期出现腹胀. 观察组和对照组动物的一般情况较好，体质量比较稳定，“三多一少”症状较模型组动物明显减轻，皮毛较光泽，后期没有观察到腹胀. 对照组、观察组动物各死亡1只，模型组动物死亡2只.

 
　　2.2肺组织的病模型组动物肺体积增大，渗出明显 ,肺缘钝圆,切面质实，包膜下有点、片状出血；观察组和对照组动物较模型组上述病变减轻. 镜下观察,模型组动物见肺泡腔缩小,肺泡数量增多，肺泡隔明显增宽, 成纤维细胞数量增加，毛细血管基底膜增厚，血管扩张淤血，腔内充满红细胞，有较多中性粒细胞浸润(图1A)；观察组和对照组动物肺组织上述改变减轻(图1B，C).
 
　　图1各组大鼠肺组织病理切片HE ×400　略

　　2.3各组动物血糖与生化指标模型组动物血糖，血肌酐（Scr），尿素氮（Bun）值明显上升，呼吸频率明显升高；观察和对照组与模型组动物相比血糖，Scr, Bun值明显下降（表1）.

　　表1各组大鼠生化指标（略）

　　2.4肺微血管内皮AQP1表达免疫组化染色显示，肺组织中肺泡周围和支气管周围的毛细血管内皮及肺泡上皮均有AQP1阳性染色(棕黄色)，且毛细血管内皮整个周缘较肺泡上皮阳性染色强. 提示AQP1主要表达于肺毛细血管内皮细胞. 模型组、对照组以及观察组相比，不同时间的AQP1特异性表达细胞类型保持不变. 模型组AQP1在毛细血管内皮细胞表达明显下降(图2A)，这种减少呈现于全肺均能观察到，非局限于损伤严重部位；观察组AQP1已基本恢复正常(图2B)，与模型组相有显著差异(P<0.05)；对照组未见AQP1有明显变化（图2C）.

　　3讨论

　　糖代谢对肺的影响非常重要. 为肺内磷酸肌酸、三磷酸腺苷、三磷脂腺苷及单磷腺苷等的来源；提供肺表面活性物质的碳分子及氨基酸、蛋白质、脂肪酸和磷脂的底物［3］. 基础研究表明高糖可以引起肺间质炎症反应，出现肺基底膜增厚和细胞外基质增生，导致肺泡萎缩，肺毛细血管管腔狭窄、通透性增加. 同时糖尿病患者易反复发生低血糖. 肺脏在高通气时可以增加葡萄糖的摄取和应用,饥饿致低血糖时可以减少葡萄糖的氧化,反复低血糖可产生肺水肿,从而导致肺通气功能及弥散功能障碍［4-5］.
 　　
　　肺泡腔和血管腔间水的快速转运有极其重要的生理功能. 水转运障碍会使肺水液代谢稳态失衡，导致肺水肿. 肺泡内水转运主要有两条途径. 一是伴随钠的主动转运；二是经肺泡上皮上的AQPs. AQP1主要表达于肺泡周围的毛细血管内皮细胞，调节肺内毛细血管与肺泡间水通透性. 有资料显示AQP1基因敲除小鼠与野生型相比，肺渗透压依赖的被动性水转运被抑制90%［6］.

　　本实验模型组大鼠出现精神萎靡、倦怠懒散及“三多一少”症状，后期出现呼吸急促等肺损伤表现.

　　图2各组大鼠肺组织AQP1免疫组化染色结果DAB ×400　略

　　观察组和对照组动物的一般情况较好，“三多一少”症状较模型组动物明显减轻，后期呼吸较平稳. 模型组动物肺组织病理可见肺体积增大,肺泡隔明显增宽,肺泡及肺间质有较多中性粒细胞浸润,符合DM肺损伤改变. 结果显示，模型组动物血糖，Scr， Bun值明显上升，呼吸频率明显升高；观察和对照组与模型组动物相比血糖，Scr， Bun值明显下降(P<0.05).
　　
　　水液代谢失常属于中医“水肿”的范畴. 中医认为其主要由情绪失调、劳倦内伤，或饮食失调而致肺、脾、肾等脏腑功能失调，导致气化不利，津液输布失常，引起水液潴留. ZHKL具有益气养阴、化瘀利水功效，主要由丹参、泽兰、黄芪等组成，临床观察提示该药在改善早期糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）患者的水肿等症状、降低Bun，Scr都有很好的疗效［7］. 我们研究发现ZHKL能显著降低DM大鼠肾组织中的AQP2蛋白和基因表达，推测ZHKL对糖尿病大鼠肾脏的保护作用可能与降低AQP2的表达有关. 《金匮要略》记载“血不利则为水”. 丹参可以通过扩张血管、加快血液流速，从而消除血液淤滞改善微循环，因此“血行则水行”,局部的水肿状态得以改善. 我们既往研究丹参注射液能增强肺气体交换功能，减轻肺充血状态；降低血ET1的水平,抑制肺内炎症反应；增加大鼠肺微血管内皮细胞AQP1表达,减轻肺水肿等的微循环病理改变. 那么ZHKL能否同样通过调节大鼠肺微血管内皮细胞AQP1表达，减轻DM大鼠肺损伤呢？

　　ZHKL不仅可降低血糖而且还能全面调理DN病变时的血液流变学情况,延缓肾小球硬化的发生,对ND变起到保护的作用［8］. 本试验模型组AQP1在毛细血管内皮细胞表达明显下降，这种减少在全肺均能观察到，而不仅仅局限于损伤严重部位. 给予ZHKL干预后大鼠肺损伤程度明显降低. 观察组大鼠肺微血管内皮细胞上表达的AQP1基本恢复正常，与模型组比较有显著差异(P<0.05). 肺微血管内皮细胞表达的AQP1有所恢复，提示AQP1表达增加对肺间质水肿液吸收有作用. 表现为肺组织渗出明显减轻；生化指标显示Scr，Bun明显低于模型组，提示ZHKL可改善肺气体交换功能，减轻肺组织渗出；调节AQP1表达,减轻肺水肿等病理改变,可能在DM肺病变的中具有较好的应用前景. 其调节AQP1表达的确切作用机制还需做进一步的研究.
 　　
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