干细胞的磁性标记及肝内活体磁共振示踪

                             作者：徐健，郑敏文，宦怡，程康，赵海涛，郑敏娟，葛雅丽，孙立军

【关键词】  肝；干细胞；移植；超顺磁性氧化铁；磁共振成像

　　In vivo MR tracking  of magnetically labeled mesenchymal stem cells in rabbit liver

　　【Abstract】  AIM： To label bone marrowderived stem cells with superparamagnetic iron oxid (SPIO) and to explore the image characteristics and signal attenuation rules of in vivo  the magnetic resonance imaging(MRI) of the labeled cells in rabbit liver.    METHODS： Marrow stem  cells  (MSCs) were isolated from rabbit and incubated with SPIO(Resovist).Cell injections into rabbit liver were conducted under the leading of ultrasound. Rabbit livers were imaged at multiple time points by MRI including T1 weighted imaging(T1WI), T2 weighted imaging(T2WI) and fast field echo(FFE) sequences to study SPIOlabeled MSCs in vivo after liver injection.  RESULTS： Labeled cells remained viable for multiple passages and retained in vitro the abilities of proliferation and differentiation. SPIO labeling caused a lower signal on MRI and a more obvious attenuation effect on FFE than on T1WI and T2WI. The signal attenuation persisted until day 30, 30 and 45 after injection and the low signal disappeared at 38,38,60 d after injection on T1WI and T2WI and FFE respectively.   CONCLUSION： SPIO labeling for MSCs is convenient and effective without hurting cell viability. MR tracking of SPIOlabeled MSCs is feasible and the ability to identify noninvasively intraliver cell implantation may be determinant for future experimental studies.

　　【Keywords】  liver; stem cells; transplantation; superparamagnetic iron oxid; magnetic resonance imaging

　　【摘要】 目的：　探讨超顺磁性氧化铁（SPIO）标记骨髓干细胞的方法和标记细胞在肝脏内的磁共振活体成像特点和衰减.  方法：  分离培养兔骨髓间充质干细胞，用SPIO标记细胞并在超声引导下局部注入兔肝脏内，然后经磁共振T1WI， T2WI和FFE序列进行移植细胞团的成像示踪. 　结果：  体外标记的骨髓干细胞见黑色铁颗粒位于细胞胞质内，标记后细胞的生长曲线与正常细胞一致. 标记的移植细胞团在肝内T1WI, T2WI和FFE序列上均呈低信号，以FFE图像信号减低最为明显并有面积增大效应. 标记细胞的信号减低区在T1WI, T2WI和FFE序列图像上分别至注射后30, 30 和45 d仍和注射前信号差异有统计学意义（P<0.05)，并分别持续至注射后38, 38 和60 d低信号才消失.  结论:  SPIO可以简便、有效地标记骨髓干细胞，且对细胞的活性没有影响；MRI可对标记后的移植细胞进行活体内示踪，并可长期动态观察，这对进一步的实验研究和疗效观察研究具有重要意义.

　　【关键词】 肝；干细胞；移植；超顺磁性氧化铁；磁共振成像

　　0引言

　　来自于骨髓的干细胞（marrow stem  cells, MSCs)，在体内与体外均能分化为功能完备的肝细胞，肝细胞移植在急慢性肝衰竭和遗传代谢性肝病方面具有很好的前景. 但移植细胞的活体内示踪和更进一步的疗效观察却是一直以来研究面临的难题. 自Weissleder等［1］于1999年提出分子影像学(molecular imaging, MI)概念后，MI已经成为影像医学和相关临床医学的研究热点. 研究者采用氧化铁颗粒标记移植干细胞进行了广泛的磁共振（MRI）活体示踪研究［2］. 国内的相关实验研究也开始起步［3-4］. 我们采用超顺磁性氧化铁（superparamagnetic iron oxide， SPIO）进行兔活体内肝干细胞的MRI示踪研究，探讨其在正常肝脏内的成像特点和代谢规律等，为进一步对肝功能不全模型进行细胞移植研究奠定预实验基础.

　　1材料和方法

　　1.1材料健康成年家兔11只，体质量2.4～3.0 kg，雌雄不拘，第四军医大学动物试验中心提供. 随机分为 ： ① 正常对照组1（n＝3），肝脏内注射未标记的骨髓干细胞； ② 正常对照组2（n=3），肝脏内注射SPIO ；③ 标记细胞组（n=5），肝脏内注射标记SPIO的MSCs.
 细胞培养基DMEM（美国Gibco公司），胰蛋白酶（美国Sigma公司），FBS（美国Gibco公司），倒置显微镜（Olympus公司），超净工作台CJ1S（天津泰斯特仪器有限公司），CO2孵箱（日本池本理化株式会社），分子天平（日立公司），离心机802（上海精密仪器厂），荧光显微镜TE 20005（日本Nikon）. ATL5000彩色多普勒超声仪. SPIO注射液（德国Schering）： 1.4 mL/支，含铁浓度0.5 mol/L，铁颗粒直径60 nm.

　　1.2方法

　　1.2.1MSCs的分离、纯化、培养用30 g/L戊巴比妥钠1 mL/kg耳缘静脉麻醉.  无菌操作下，分别在双侧髂后上棘与髂骨平行，由内上向外下穿入，每只抽取暗红色骨髓约2～3 mL. 将抽取的骨髓加入到含5 mL DMEM液的无菌离心管中，充分混匀. 再把上述细胞悬液缓慢层加到含有4 mL淋巴细胞分离液(比重为1077 g/L)的无菌离心试管中,可见液体分层. 常温下2000 r/min离心20 min后，可见离心试管内液体分为3层. 收集中间云雾层的骨髓单个核细胞，加入到含4 mL DMEM培养液的无菌离心管中，常温下以1500 r/min离心洗涤10 min两次后，倾去上清，然后用含肝细胞生长因子（HGF）20 mg/L的DMEM培养液混悬. 将分离的细胞进行计数，然后以2×108/L密度接种于25 mL培养瓶. 接种后将培养瓶置于37℃，50 mL/L  CO2及饱和湿度的孵箱中培养. 72 h后更换培养液，此后视细胞生长状态每周换液2次.
 
　　1.2.2MSCs的体外标记和铁浓度测定/标记率测定原代的MSCs培养液 8 mL，含细胞量1×106，Revosite与之按1∶80的比率加入100 μL，在37℃, 50 mL/L CO2条件下共同孵化过夜，24 h后用PBS液清洗两遍，然后加入2.5 g/L胰蛋白酶1～2 mL，静置2～3 min，将胰蛋白酶倾倒，加入含100 mL/L胎牛血清（FBS）的DMEM培养液终止消化，用弯头吸管反复吹打，使细胞完全脱落，制成细胞悬液，倒置显微镜下观察并测量MSCs内铁粒子的标记率. 1000 r/min离心洗涤5 min获得标记MSCs，注射前以生理盐水1 mL将细胞重悬.

　　1.2.3体外培养条件下MSCs的生长曲线将传1代的MSCs制成细胞悬液，按照1×104个/孔的细胞密度接种于3个24孔板中，接种后每隔24 h按顺序检测3个孔的细胞数.

　　1.2.4超声引导下标记细胞肝脏内注射将兔腹腔内麻醉后，固定于动物小型手术台上，局部剪毛消毒，在超声引导下将1 mL注射器针头进针定位于肝脏左叶，推入注射器内1 mL标记的 MSCs溶液.

　　1.2.5磁共振成像序列和方法术后即刻,1, 3, 7, 10 d,  2, 3 wk分别行MR检查. 采用Philips Gyroscan Intera Master 1.5T超导磁共振扫描仪，膝关节线圈，麻醉后俯卧位固定. 扫描序列为T1WI/SE，T2WI/TSE，T2WI/FFE.

　　1.2.6图像分析与数据测量对比分析不同时间点标记细胞低信号团的大小变化，并测量注射前和注射后不同时间点肝脏靶区T1WI、T2WI和FFE序列上的信号强度，信号强度前后变化百分比［（信号强度注射后-信号强度注射前/信号强度注射前）×100％］. 

　　1.2.7移植细胞的组织学检查家兔耳缘静脉注入10 mL空气处死，打开腹腔离体肝脏，取左叶注射点局部肝组织常规石蜡包埋，连续切片交叉行HE染色和普鲁士兰染色.  

　　统计学处理： 对测量结果采用SPSS12.0统计分析软件进行多组间均数比较的方差分析（LSDt检验），所有数据均表示为x±s.

　　2结果

　　2.1MSCs的原代培养MSCs悬液接种后24 h开始有细胞贴壁，且摇晃瓶身贴壁细胞不易脱落. 初期的贴壁细胞多为球形或短梭形，72 h完全换液后可见贴壁细胞分裂增殖(图1)，用图像分析仪在显微镜下随机测量20个细胞的直径，平均为40 μm. 培养5～7 d后细胞分裂增殖明显，出现形态均一的细胞增殖集落，形态也渐变为长梭形，约8～12 d贴壁生长的细胞即可融合形成单层.

　　图1兔骨髓干细胞培养72 h×400　略

　　2.2MSCs的体外标记观察及标记率测定孵化过夜后倒置显微镜观察所有细胞的胞质内均可见或多或少的黑色铁颗粒，多的细胞质内全为黑色，少的则为散在细沙样黑颗粒（图2），随机镜下观察10个高倍镜视野均是如此，标记率基本达到100%. 随时间生长曲线呈上升趋势（图3）.

　　图2标记后的兔骨髓干细胞×400　略

　　图3兔骨髓干细胞生长曲线　略

　　2.3超声引导下定位注射点在超声引导下可明确观察到针头定位于肝脏左叶，并可见注入的高回声标记MSCs溶液团.

　　2.4细胞移植后MRI活体内示踪正常对照组1未标记的MSCs注入肝脏左叶后MRI均未显示；正常对照组2注射单纯SPIO后24 h内均显示信号减低团，但24 h后即显示不明显，72 h后则完全不显示；标记SPIO的干细胞注射组：MRI各个扫描序列T1WI, T2WI和FFE上均可见肝脏左叶标记细胞注射区域的信号减低，以FFE信号减低最为显著且有靶区面积增大效应（图4～6）. 同时间点不同序列靶区信号减低大小不尽相同，FFE＞T2WI＞T1WI，不同时间点同一序列靶区逐渐变小，T1WI和 T2WI改变较为一致，FFE靶区减小缓慢. 所测肝脏和标记细胞注射区域T1WI, T2WI相上的不同信号强度见表1. T1WI图像SPIO注射前与注射后直到30 d靶区信号强度差异有统计学意义（P＜0.05)；T2WI图像SPIO注射前与注射后直到30 d靶区信号强度差异有统计学意义（P＜0.05)；FFE图像SPIO注射前与注射后直到45 d靶区信号强度差异有统计学意义（P＜0.05). 注射区域信号改变持续直到术后50 d仍可见.

　　图4－图6　略

　　表1兔肝内注射标记细胞前、后不同时间T1WI, T2WI, FFE图像的信号强度(略)

　　2.5组织学检查HE染色仅见正常肝细胞及其他结构，普鲁士蓝染色则可显示注射部位细胞间有特异性蓝染的标记细胞铁颗粒，注射后即刻处死时铁颗粒浓聚，注射后2 mo显示注射部位铁颗粒稀疏.
 
　　3讨论
　　
　　由于常规MRI成像无法区分移植细胞和靶组织细胞，为使移植细胞能在MRI上特异性显示，一般均使用SPIO作为标记物标记移植细胞［5］，因为铁是顺磁性物质，被网状内皮系统（在肝脏主要是枯否细胞）摄取后可引起局部磁场不均匀造成邻近质子自旋快速失相位而缩短组织T2时间，从而大大降低靶病灶T2WI图像的信号强度而使其特异性显示. 因此，注入的标记干细胞团因含铁颗粒而显示为低信号，也就间接反映了移植细胞的分布和聚集情况.
 　　
　　在体外，由于细胞膜和氧化铁颗粒都带有负电荷，所以未经修饰的氧化铁无法有效标记干细胞. 目前多采用带正电荷的转染剂如多聚赖氨酸PLL ［6］、硫酸鱼精蛋白、繁枝体等，通过静电荷作用包裹氧化铁颗粒，使带负电荷的细胞通过非特异性膜表面吸收过程摄取铁颗粒进入细胞内. 这样移植细胞的氧化铁颗粒标记就变得非常简单，只需将分离、纯化的移植细胞放入一定浓度修饰后的铁溶液经体外孵化过夜24 h，含铁颗粒即可进入移植细胞内，标记率可达到99％［7］. 我们采用的SPIO为羧基右旋糖苷（Carboxydextran）包裹的氧化铁纳米颗粒成品制剂，标记率达到100％. SPIO作为标记移植细胞的对比剂被证实不同的浓度对细胞的生存能力、功能均无不利影响，亦无毒性［8］. Himes等［9］对标记的心肌干细胞体外观察第14日仍然具有和未标记细胞相似的活性. 我们对标记细胞的体外生长曲线图也证实SPIO允许细胞保持其生物活性和正常的增殖能力. 但对鼠干细胞的成像实验研究证实，当标记率大于100 g Fe/L干细胞培养液时，肝细胞的增殖能力即被充分限制，一般应用剂量应小于50 g Fe/L移植细胞培养液［10］.
 　　
　　研究证实未标记的SPIO 24 h后即不再显示明确的低信号，说明细胞外的SPIO在器官内存留时间较短. 本实验正常对照组2注射未标记的SPIO后MRI成像观察结果也与此一致. 本实验结果显示注入的标记细胞团随着时间的推移成像面积逐渐减小，信号减低强度也呈逐步减弱趋势. 由于标记细胞经组织学证实局部存活，因此信号的减低可以认为主要是由于铁颗粒的排出引起的. 我们采用氧化铁纳米颗粒，在肝脏的成像时间持续至注射后45 d，说明了纳米铁颗粒在肝脏内的保持力较长.
　　
　　SPIO的顺磁性可以使MRI的T1WI, T2WI和FFE图像的靶区信号均明显降低，产生负性对比剂的效应. Kustermann等［11］对比了注射标记细胞前信号衰减的心梗区在质子密度加权图像和T2*WI图像上的大小是一样的，但注射标记铁颗粒的细胞后T2*WI图像上的心梗信号衰减区域则大于质子密度加权图像的心梗信号衰减区，说明T2*WI对SPIO最为敏感，其信号减低效应可增大靶区面积. 这在我们的实验中也得到了证实. 注射后每次进行的3个序列的成像图均显示FFE靶区面积最大，其次为T2WI和T1WI图像；另外当标记的移植细胞团低信号区于注射后3, 7 d开始减小时，相应的FFE图像该靶区低信号改变仍然十分明显，减小的趋势也缓慢，同样说明FFE对SPIO最为敏感.
　　
　　本实验的结果显示SPIO可简便、有效地标记MSCs，并进行活体内肝脏移植细胞的MRI示踪成像研究，标记的肝干细胞在体内存留时间长达1 mo以上，可满足长期动态的随访和疗效观察，对进一步的动物实验研究和临床应用研究具有重要指导意义.

　　【】

　　［1］ Weissleder R,Mahmood U. Molecular imaging ［J］. Radiology,2001,219(2):316-333.

　　［2］ Bulte JW, Kraitchman DL. Iron oxide MR contrast agents for molecular and cellular imaging ［J］.NMR Biomed, 2004,17(7):484-499.

　　［3］ 景猛，刘新权，梁鹏，等.  应用超顺磁性氧化铁纳米粒子标记神经干细胞及活体磁共振示踪的实验研究 ［J］. 中华医学杂志，2004，84（16）：1386-1389.

　　［4］ 居胜红，滕皋军，毛曦，等.  脐血间充质干细胞磁探针标记和MR成像研究 ［J］.中华放射学杂志，2005，39（1）：101-106.

　　［5］ Arbab AS, Bashaw LA, Miller BR, et al. Characterization of biophysical and metabolic properties of cells labeled with superparamagnetic iron oxide nanoparticles and transfection agent for cellular MR imaging ［J］. Radiology, 2003, 229(3):838-846.

　　［6］ Frank JA, Miller BR, Arbab AS, et al. Clinically applicable labeling of mammalian and stem cells by combining superparamagnetic iron oxides and transfection agents ［J］. Radiology，2003,228(2):480-487.

　　［7］ Hill JM, Dick AJ, Raman VK, et al. Serial cardiac magnetic resonance imaging of injected mesenchymal stem cells［J］ . Circulation，2003,108(8):1009-1014.

　　［8］ Arbab AS, Bashaw LA, Miller BR, et al.Intracytoplasmic tagging of cells with ferumoxides and transfection agent for cellular magnetic resonance imaging after cell transplantation: methods and techniques ［J］. Transplantation，2003,76(7):1123-1130.

　　［9］ Himes N, Min JY, Lee R, et al. In vivo MRI of embryonic stem cells in a mouse model of myocardial infarction ［J］.Magn Reson Med，2004 ,52(5):1214-1219.

　　［10］Bos C, Delmas Y, Desmouliere A,et al. In vivo MR imaging of intravascularly injected magnetically labeled mesenchymal stem cells in rat kidney and liver ［J］. Radiology， 2004,233(3):781-789.

　　［11］ Kustermann E, Roell W, Breitbach M, et al. Stem cell implantation in ischemic mouse heart: A highresolution magnetic resonance imaging investigation［J］ . NMR Biomed, 2005,18(6):362-370.