人Lrp蛋白多克隆抗体的制备

                        作者：于欣平，宋庆贺，侯立朝，杜可军，熊利泽，陈苏民，陈南春，代忠明

【摘要】  目的：制备人Lrp蛋白多克隆抗体. 方法：克隆全长lrp?cDNA编码序列并进行原核表达与鉴定. 用镍离子螯合柱(Ni?NTA)纯化原核表达的全长Lrp蛋白，获得纯度较高的目的蛋白. 用纯化后蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体并吸附去除非特异性反应成分. 结果：Western印迹结果表明，纯化前后的抗血清在69 ku处均检测到目的蛋白条带，说明吸附纯化后的抗体可以与Lrp蛋白特异结合. 而纯化后抗体Western印迹结果目的条带只有一条，说明吸附纯化后得到高特异性抗血清，其免疫印迹的效价在10-6以上，有较高免疫印迹滴度. 结论：成功制备了高效价高特异性的兔抗人Lrp蛋白的多克隆抗体，为Lrp功能的进一步研究提供了重要的实验工具.

【关键词】  脂多糖类

　　0引言

　　脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）是细菌内毒素，是革兰氏阴性（G-）细菌感染的主要致病因子，它与某些炎症的发生密切相关［1］. 探讨脂多糖刺激后表达发生改变的基因的功能，有针对性地研究其在LPS信号转导通路中的作用部位及作用性质，有助于增加对炎症反应分子机制的认识. 人lrp（lipopolysaccharide responsed gene, lrp）是一种脂多糖应答基因. 系本课题组采用基于PCR的改良消减杂交技术，从LPS刺激后的人牙髓细胞差异表达基因文库中筛选出的应答基因［2］，GenBank录入号为AF143740. 但当时得到的只是该基因编码N?端186个氨基酸的序列. 随后全长cDNA也被克隆并录入GenBank（录入号NM018360）. 本课题组克隆了全长lrp?cDNA编码序列并进行了原核表达与鉴定［3］. 分析表明，全长人lrp编码528个氨基酸，并有亮氨酸拉链的特征结构. 本实验对原核表达的Lrp蛋白进行纯化，用纯化后的蛋白免疫新西兰大白兔制备抗血清.

　　1材料和方法

　　1.1材料大肠杆菌BL21(DE3)由本室保存；重组人lrp 融合表达载体pcTAT?hlrp由本课题组构建保存. LPS(Sigma公司)；HRP标记的羊抗兔IgG及化学发光底物(Pierce公司)；弗氏完全、不完全佐剂(GibcoBRL公司)；Ni?NTA纯化系统(Qiagen公司)；纯种新西兰大白兔(第四军医大学实验动物中心).

　　1.2方法

　　1.2.1Lrp的表达纯化将重组人lrp融合表达载体pcTAT?hlrp转化转化BL21（DE3）感受态细菌，挑单菌落扩大培养后IPTG（终浓度为0.2 mmol/L）诱导表达6His?TAT?Lrp融合蛋白. 将诱导后的菌液2292 g/min离心10 min，收集菌体，用STE (100 g/L蔗糖, 10 mmol/L Tris?Cl pH 8.0, 1 mmol/L EDTA pH 8.0)洗1遍；离心收集菌体后用STE重悬，超声破碎菌体(整个过程均在冰浴中)，13 201 g，4℃，离心30 min，收集包涵体沉淀，再用包涵体溶解缓冲液（50 mmol/L Tris?Cl pH 8.0, 1 mmol/L EDTA pH 8.0, 100 mmol/L NaCl, 8 mol/L尿素）溶解沉淀，13 201 g/min，4℃，离心30 min，收集上清；用镍离子金属螯合柱(Ni?NTA)纯化Lrp蛋白(按公司提供的操作说明进行)，并作SDS?PAGE分析.

　　1.2.2抗体制备用约40 μg纯化的Lrp蛋白于脊柱两侧多点注射免疫新西兰大白兔，免疫周期为0 d, 7 d, 28 d, 35 d. 第1次加弗氏完全佐剂，其余3次加弗氏不完全佐剂. 第4次免疫1 wk后颈动脉取血，37℃静置12 h分离血清，1467 g/min 离心10 min去除残留红细胞. 将制备的抗血清按1∶104稀释，以免疫前兔血清为对照对诱导表达Lrp后的全菌蛋白样品进进行Western Blot分析检测抗体.

　　1.2.3抗Lrp抗血清的吸附纯化和特异性鉴定培养转化pcTAT载体的BL21（DE3），收菌后用STE重悬浮菌体沉淀，加入溶菌酶（每克湿菌3 mg）作用1.5 h，加脱氧胆酸钠（每克湿菌4 mg）搅动10 min，再加1 g/L的DNaseⅠ（每克湿菌4 μL），搅拌直至不再粘稠(以上操作均在冰浴进行)；此时向裂菌液中加入等体积的4℃预冷丙酮，混匀，冰浴30 min沉淀全菌蛋白，然后5867 g, 4℃离心10 min收取全菌蛋白沉淀；沉淀用PBS洗涤1遍后与所制备抗血清于37℃摇动共孵2 h吸附去除非特异性反应成分. 将吸附前和吸附后的抗体分别按1∶103, 1∶104, 1∶105, 1∶106稀释作一抗，对诱导表达Lrp后的全菌蛋白样品进行Western Blot分析.

　　2结果

　　2.1Lrp蛋白的表达与纯化诱导2 L菌液，表达后的工程菌经超声裂解后分别取上清和沉淀样品进行蛋白电泳，结果显示目的蛋白在包涵体中（图1）. 将所得包涵体用包涵体溶解缓冲液溶解后经Ni?NTA一步纯化. 得到约8 mg蛋白，且纯度较高(图2).

　　图1－图2　略

　　2.2抗血清的检测用收集未纯化抗血清作一抗，以免疫前兔血清为对照对诱导表达Lrp后的全菌蛋白样品进进行Western Blot分析，结果显示（图3），用所制备的抗血清在69 ku位置明显杂到了一条预期的条带，而对照血清泳道相同位置处无相应条带出现. 说明所制备抗血清中确有一定浓度的抗目的蛋白的抗体.

　　图3所制备抗血清的Western Blot检测　略

　　2.3Lrp抗体的制备纯化及特异性鉴定免疫新西兰大白兔后，获得抗血清. 抗体吸附纯化后，以分别按1∶103, 1∶104, 1∶105, 1∶106稀释纯化前和纯化后的抗兔血清作为一抗，用Western印迹方法检测全菌蛋白样品. 结果显示（图4, 5），纯化前后的抗血清在69 ku处均检测到了目的蛋白条带，说明所制备抗体可以与所表达目的蛋白结合；但纯化前抗体所检测到的非特异条带较多，而纯化后抗体Western印迹结果就只有一条目的条带. 说明吸附纯化后得到了高特异性的抗血清，并且其免疫印迹的效价在10-6以上.

　　图4－图5　略

　　3讨论

　　LPS是细菌内毒素，与某些炎症的发生密切相关［1］. 它是G-细菌感染的主要致病因子,也是一种危及人类健康乃至生命的重要的病原菌相关模式分子(pathogen?associated molecular pattern, PAMP). LPS进入体循环时,就会形成内毒素血症,引起明显的病理生理反应.
　　
　　近年来的实验显示［4］, LPS除引起危及生命的G-菌毒血症外, 也参与一些局部特定疾病，如泌尿系统、心血管系统、呼吸系统、消化系统等多个系统疾病. 目前认为LPS也是引起人和实验动物中毒性休克的主要因素［5］. 而所有这些作用的发挥，都是藉一系列被称为模式识别受体(pattern recognition receptors, PRRs)［6］的膜蛋白分子对LPS识别［7-9］，以及一系列相关的胞内信号传导途径对所识别信号的传递和放大来实现的. LPS信号传导途径非常复杂，单凭现有的信号传导分子很难解释其中的一些通路. 研究LPS的致病机制，必须寻找新的信号传导分子.
　　
　　人lrp就是新发现的一种LPS应答基因. 功能位点的分析发现, lrp的基因序列中包含两条相互重叠的亮氨酸拉链结构［L?x(6)? L?x(6)?L?x(6)?L］. 亮氨酸拉链结构是DNA结合蛋白的特征型结构，该结构往往出现在几种特定的蛋白质中：即与细胞生长代谢相关的分子中（如转录因子、癌基因）. 对lrp进行研究可能会有助于进一步认识LPS介导的信号转导通路，增加对炎症反应分子机制的认识. 并可能为内毒素血症等LPS相关疾病寻找新的靶点.
　　
　　本实验成功制备了高效价高特异性的兔抗人Lrp蛋白的多克隆抗体，为Lrp功能的进一步研究提供了重要的实验工具.

【】
  　　［1］ 宋庆贺, 柴玉波, 陈苏民,等. 人lrp?cDNA全长编码区的克隆及其在大肠杆菌中的表达［J］. 第四军医大学学报, 2006,27(5):458-461.

　　［2］ Zhao ZL. Direct cloning of cell differential expression genes with full length by a new strategy［J］. J Biotechnol, 1999,73(1):35-42.

　　［3］ Chai YB. Development of an improved subtractive hybridization and batch cloning of LPS specific response genes from human dental pulp cells［J］. J Dental Res, 2001, 18(5):126-130.

　　［4］ Inada T, Hamano N, Yamada M, et al. Inducible nitric oxide synthase and tumor necrosis factor?alpha in delayed gastric emptying and gastrointestinal transit induced by lipopolysaccharide in mice［J］. Braz J Med Biol Res, 2006, 39(11):1425-1434.

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　　［7］ Tang X, Metzger D, Leeman S, et al. LPS?induced TNF?alpha factor (LITAF)?deficient mice express reduced LPS?induced cytokine: Evidence for LITAF?dependent LPS signaling pathways［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 2006,103(37):13777-13782.

　　［8］ Trent MS, Stead CM, Tran AX, et al. Diversity of endotoxin and its impact on pathogenesis［J］. J Endotoxin Res, 2006,12(4):205-223.

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