慢性HCV感染患者PBMC体外Th1类细胞因子分泌及其相关因素分析

                   作者：李跃旗，许鹏辉，苏海滨 ，迟淑萍，朱雷，戚扬，李金波，程云

【摘要】  目的：研究慢性HCV（丙型肝炎病毒）感染患者外周血单个核细胞（PBMC）体外Th1类细胞因子的分泌，进一步了解HCV感染慢性化和肝损伤机制. 方法：体外培养慢性HCV感染患者PBMC 72 h后，ELISA检测培养上清Th1类细胞因子(IL?2，IFN?γ，TNF?α)，荧光定量PCR检测患者血清HCV RNA含量，RT?PCR检测HCV RNA亚型. 结果：与正常人相比，IFN?γ在HCV RNA阴性患者中明显增高，而在RNA阳性患者中无明显升高. TNF?α则不论RNA滴度的高低均较正常人显著增高. RNA阳性患者ALT（丙氨酸氨基转移酶），AST（门冬氨酸氨基转移酶）水平明显高于阴性患者. 不同HCV基因型感染的患者IFN?γ，TNF?α的分泌无显著差异. 结论：IFN?γ在清除病毒中起重要作用，TNF?α是引起肝脏损伤的重要因素之一.

【关键词】  C型肝炎样病毒属

　　0引言

　　HCV（丙型肝炎病毒）感染后易于慢性化，但其慢性化机制仍不十分清楚. 有研究［1-2］表明，天然免疫、体液免疫以及细胞免疫均对病毒的清除有重要作用，而细胞免疫尤为重要. Th1类细胞因子是参与细胞免疫的重要物质，在细胞清除细胞内病原体的免疫应答过程中起关键作用，但同时也是诱发肝脏损伤的重要机制. 我们比较了HCV感染后体内不同病毒滴度及不同的基因型患者的外周血单个核细胞（PBMC）体外分泌Th1类细胞因子及肝脏的炎症情况，以进一步了解HCV感染慢性化和肝损伤机制.

　　1对象和方法

　　1.1对象收集我院2005年门诊或住院的慢性HCV感染患者44（男35，女9）例， 平均年龄42.3（15～67）岁，所有病例均符合2000年西安全国第十次病毒性肝炎及肝病学术会议修订的《病毒性肝炎防治方案》慢性HCV感染诊断标准［3］. 对照10例为健康献血员. 淋巴细胞提取液、Trizol、细胞因子ELISA检测试剂盒（晶美公司）；AMV（逆转录酶），RNA酶抑制剂、dNTP，Taq酶（Promega公司）；RPMI 1640母液（Gibico公司）；GeneAMP5700型HCVRNA定量检测仪（美国ABI公司）；AU600肝功能检测仪（Olympus公司）；其他试剂均购自北京中生公司产品.

　　1.2方法

　　1.2.1外周血PBMC的提取采用Ficoll梯度离心法.

　　1.2.2PBMC体外培养后上清细胞因子的检测将分离所得PBMC用含有100 mL/L混合人血清的完全RPMI 1640培养液稀释细胞密度为5×109/L，以100 μL/孔加于96孔板，37℃，50 mL/L CO2孵箱中培养，72 h后收集培养上清，-20℃冻存. 同时设不加细胞的阴性对照和加入ConA(刀豆蛋白，2 mg/L)刺激的阳性对照.

　　1.2.3检测项目全部病例采用荧光定量PCR检测HCV RNA滴度，肝功能检测由我院临床检验中心完成.

　　1.2.4血清HCV RNA基因分型参照［4］进行. Trizol提取血清中总RNA，逆转录合成cDNA，引物：5′?ATGTACCCCATGAGGTCGGC?3′. 巢式PCR进行RNA分型鉴定. 第1轮PCR引物：正义：5′?CGCGCGACTAGGAAGACTTC ?3′；反义：5′?ATGTACCCCATGAGGTCGGC?3′，94℃变性1 min，55℃复性1.5 min，72℃延伸2 min，35个循环. 第2轮PCR以第1轮PCR产物为模板，使用同一个正义引物和4个型特异性反义引物，正义：5′?AGGAAGAC TTCCGAGGGGTC?3′，反义：5′?TGCCTTGGGGATAGGCTGAC?3′（Ⅰ型，57 bp）；5′?GAGCCATCCTGCCCACCCCA ?3′（Ⅱ型,144 bp）；5′?CCAAGAGGGACGGGAACCTA?3′（Ⅲ型,174 bp）；5′?ACCCTCGTTTCCGTACAGAG ?3′（Ⅳ,135 bp），94℃变性1 min，60℃复性1 min，72℃延伸1.5 min，30个循环. PCR产物15 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定.
　　
　　统计学处理：用STATA7.0软件进行统计学处理，两组间比较采用t检验.

　　2结果

　　2.1HCV感染患者PBMC体外培养72 h后Th1类细胞因子的分泌培养72 h后，对照及所有HCV患者PBMC培养上清中均未检测到IL?2. HCV RNA阴性（RNA<106拷贝/L）患者IFN?γ［（55±33） ng/L］较正常人［（34±14） ng/L ］和RNA大于109拷贝/L的患者［（29±20） ng/L］明显增高（图1），而所有RNA阳性患者与对照相比无显著差异. TNF?α不论RNA滴度高低均较对照显著增高；RNA不同滴度的患者间无显著差异.

　　2.2不同HCV RNA滴度情况下患者肝脏功能间的比较RNA阳性患者ALT，AST水平明显高于阴性患者（表1），其余肝脏功能指标两组患者间无明显差异.

　　2.3不同HCVRNA基因型Th1类细胞因子的分泌对34例HCV RNA阳性患者进行HCV RNA分型，21例Ⅱ/1b（62%），5例Ⅲ/2a（15%），8例（23%）未分出（表2）. 不论HCV RNA为何种基因型，PBMC体外培养后IFN?γ的分泌都较对照组无显著差异，而TNF?α则均较对照组明显增高. 但各基因型之间IFN?γ，TNF?α均无显著差异.

　　图1在不同HCV RNA滴度下的PBMC IFN?γ和TNF?α的分泌水平　略

　　表1不同HCV RNA滴度情况下患者的肝脏功能（略）

　　表2不同的HCV RNA基因型Th1类细胞因子的分泌（略）

　　3讨论

　　虽然HCV感染后可诱导机体产生特异性的抗体，但HCV感染仍倾向于慢性化，可能原因是HCV在免疫压力的诱导下中和性表位发生变异，致使已产生的抗体不能中和病毒［5］. 因此，细胞免疫在HCV感染后的清除过程中可能起到决定性作用［6］. 有研究表明，在感染HCV后自发清除病毒的患者中，其体内Th1类细胞因子（IFN?γ，TNF?α）的产生显著高于病毒持续存在的患者［7］. 此外，在HCV感染后不论是否清除病毒，均可诱导机体产生特异性的细胞免疫，但免疫应答的强度不足以清除病毒，从而致使病毒长期存在［8］.
　　
　　IFN?γ主要由NK细胞、CD8+T淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞分泌，可增强抗原提呈细胞的吞噬能力，促进MHCI，II类抗原的表达、IL?12的分泌，诱导机体免疫应答向Th1类分化［9］,同时其本身也具有抗病毒作用. 我们的实验表明，慢性HCV感染患者PBMC体外培养后，在HCVRNA阴性（<106拷贝/L）患者中，IFN?γ，TNF?α的产生明显高于正常人，而在HCVRNA阳性患者中，不论滴度的高低，TNF?α均有所升高，但IFN?γ的产生却与正常人无显著差异，且HCVRNA滴度越高，IFN?γ的产生越低. 这在一定程度上表明，IFN?γ在病毒清除中起重要作用，细胞因子（IFN?γ，TNF?α）分泌的不平衡可能是导致病毒不能清除的原因之一.
　　
　　细胞免疫在HCV感染中具有双重作用，HCV感染后诱导机体产生的Th1类细胞因子（IFN?γ，TNF?α）虽然不足以清除病毒，但仍可诱导机体肝脏损伤［10］. IFN?γ，TNF?α同时具有抗病毒和明显的诱发炎症作用，在HCV感染后引起肝脏损伤中起重要作用. 我们的实验发现，在RNA阳性患者中，代表肝脏炎症指标的ALT，AST较RNA阴性患者明显增高，且TNF?α也较正常人明显增高，表明RNA含量与病毒引起的肝脏损伤有一定关系，这可能由于在RNA阳性患者中，由于IFN?γ分泌不足，单独的TNF?α升高表现为肝损伤为主，但不足以清除病毒. 而在RNA阴性、肝功能正常的患者，虽然TNF?α也明显增高，但IFN?γ同时增高，二者一同起到了抗病毒的协同作用，体内病毒含量的减少使得肝脏炎症减轻. 另外，虽然RNA阴性患者表现为ALT，AST正常，但其诱导产生的免疫应答仍有可能造成损伤，肝脏炎症依然存在，病理检查将有助于进一步的明确.
　　
　　在我国，HCV基因型Ⅱ/1b，Ⅲ/2a为主要感染病毒株，在我们的研究中基因型Ⅱ/1b，Ⅲ/2a占RNA阳性患者的76%,各基因型之间IFN?γ，TNF?α的分泌均无显著差异，提示慢性HCV感染后诱导产生的免疫应答与基因型无关.

【】
  　［1］ Mizukoshi E, Rehermann B. Immune responses and immunity in hepatitis C virus infection［J］. J Gastroenterol， 2001， 36(12): 799-808.

　　［2］ Thimme R, Lohmann V, Weber FA. Target on the move: Innate and adaptive immune escape strategies of hepatitis C virus［J］. Antiviral Res, 2006，69(3): 129–141.

　　［3］ 中华医学会传染病与寄生虫病学分会、肝病学分会. 病毒性肝炎防治方案［J］.中华肝脏病杂志, 2000， 8(6)：249-250.

　　［4］ Hiroaki O, Yasushi S, Shunichi O, et al. Typing hepatitis C rirus by polymerase chain reaction with type?specific primers: Application to clinical surveys and tracing infectious sources［J］. J General Virol, 1992， 73(3): 673-679.

　　［5］ Pavio N, Lai MM. The hepatitis C virus persistence: how to evade the immune system? ［J］. J Biosci, 2003， 28(3): 287-304.

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　　［9］ Szabo SJ, Sullivan BM, Peng SL, et al. Molecularmechanisms regulating Th1 immune responses［J］. Annu Rev Immunol, 2003， 21: 713-758.

　　［10］ Sun J, Li K, Shata MT, et al. The immunologic basis for hepatitis C infection［J］. Curr Opin Gastroenterol, 2004， 20(6): 598-602.