牙科用Ti?6Al?7Nb合金的体外细胞毒性研究

                                              作者：李凯 周伟群 李军 刘丹 李璇 

【摘要】  　　目的： 通过MTT试验评价Ti?6Al?7Nb合金的细胞毒性并与现阶段常用的Ti?6Al?4V合金对比. 方法： 依照国家医疗器械标准（GB/T16886），选择L929细胞系做为细胞毒性的实验对象，观察L929细胞在Ti?6Al?7Nb合金离子析出培养液中的生长情况，并通过MTT试验得出细胞在培养第1, 3, 5, 7日的A值. 通过对Ti?6Al?7Nb合金做出细胞毒性分级评价. 结果：Ti?6Al?7Nb合金在各时间点的A值均高于Ti?6Al?4V合金，实验组与空白组间无统计学差异（P>0.05）. 实验细胞在Ti?6Al?7Nb合金浸提液中生长旺盛，细胞形态正常. 细胞毒性分组为0级. 结论： Ti?6Al?7Nb合金没有明显的细胞毒性，是一种理想的生物医用钛合金.

【关键词】  Ti?6Al?7Nb合金 细胞毒性 生物相容性材料

       0引言

    　生物医学材料( biomaterials)或叫生物材料,是和生物系统作用,用以诊断、修复或替换机体中的组织、器官或增进其功能的材料. 生物医用金属材料属于生物惰性材料,其主要用于硬组织修复和替换,也用于心血管和软组织等的修复［1］. 钛合金具有强度高、弹性模量较低、耐腐蚀性、易加工成形,不会产生过敏以及在金属材料中拥有最好的生物相容性等优点,是一种理想的医用植入材料［2］. 目前80%以上的钛合金植入物产品仍在使用Ti?6Al?4V ELI (Ti?6Al?4V extra low interstitial). 由于V的毒性已经证实,用Nb置换V后, (α+β)相的Ti?6Al?7Nb合金(瑞士)于20世纪80年代问世［3-5］. 我国虽然仿制了此合金，但是切较少用于临床. 我们通过MTT试验检测培养细胞A值，评价Ti?6Al?7Nb合金的细胞毒性.

    1材料和方法

    1.1材料MTT(Sigma，USA) 全称为溴化?3?(4，5?二甲基噻唑基?2)?2, 6二苯基四唑. 试验前用PBS(pH 7.4, 5 g/L)新鲜配制,过滤除菌；胎牛血清（fetal bovin serum, FBS,杭州四季青生物工程材料有限公司）；DMEM培养液(Gibco, USA)内含100 mL/L FBS，青霉素100 kU/L，链霉素100 KU/L, 10 g/L谷氨酰胺、pH 7.2 ；二甲基亚砜DMSO(Amresco, USA)；胰蛋白酶（PBS配制浓度为2.5 g/L，pH 7.2；96孔培养板（Costar, USA）；CO2恒温培养箱（Hera cell, Germany）；倒置相差显微镜（ck?40, Olmypus, Japan）；SW?CJ?2FD型超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；Powerwave340型酶联检测仪（Bio?TEK Instrument, USA）；DL?360A超声波清洗器（上海之信仪器有限公司）.

    1.2方法

    1.2.1合金试件及其浸提液的制备将Ti?6Al?7Nb合金（实验组）、Ti?6Al?4V合金（对照组）、纯钛（阴性组）制备成直径5 mm厚度1 mm的圆型金属片. 表面抛光后依次用无水乙醇浸泡脱脂，超声波清洗器清洗15 min，三蒸水冲洗3遍热风烘干后，在121℃下，高压蒸汽灭菌20 min备用. 合金浸提液采用含100 mL/L FBS的DMEM培养液，试件按表面积与培养液之比为3×103 cm2/L加入培养液，置于37℃培养箱内72 h使金属离子尽可能多的析出，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，制备出材料浸提液. 阳性对照组为含6.4 g/L苯酚的培养液，空白对照组为DMEM培养液.

    1.2.2细胞生长曲线的绘制选用L?929细胞（第四军医大学口腔生物学实验室提供）传代48~72 h，取生长旺盛的细胞制备10种不同浓度细胞悬液. 将其依次加入96孔培养板，每孔200 μL，每种浓度8孔. 使每孔接种细胞数依次为1×101/孔、 1×102/孔、1×103/孔至1×1010/孔置于50 mL/L CO2, 37℃恒温培养箱内培养72 h，然后每孔内加入配制好的MTT液20 μL继续孵育4  h终止培养. 小心弃去原培养液用PBS液冲洗3遍后每孔加入150 μL DMSO,室温下振荡培养板10 min使结晶物充分溶解呈色更加均匀. 选择490 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔A值，并计算出每种细胞浓度下A值的均数. 记录结果以细胞数为横轴，A值为纵轴绘制细胞生长曲线，本实验重复两次.

    1.2.3细胞毒性测定及形态学观察将对数生长期的L?929细胞用胰蛋白酶消化后用培养液制备成浓度为1×107/L的细胞悬液，接种于4块96孔培养板,每种材料接种8孔. 每孔加入100 μL细胞悬液，37℃ , 50 mL/L CO2条件下培养24 h，待细胞贴壁生长后弃去原培养液. PBS冲洗3遍后分别加入三种合金材料的浸提液和DMEM培养液及含6.4 g/L苯酚的培养液. 每孔100 μL继续培养，于3 d, 5 d更换材料浸提液. 1, 3, 5, 7 d各取一块培养板在倒置相差显微镜下观察细胞形态并照相. 每孔加入MTT20 μL后继续培养4 h，小心抽出每孔内浸提液，PBS冲洗后每孔加入150 μL DMSO. 振荡培养板10 min，490 nm波长下用酶联免疫检测仪上测定各孔A值.

    统计学处理： 采用SPSS11.0软件进行统计学分析，数据以x±s表示，采用方差检验，P<0.05表示有统计学差异.

    2结果

    2.1标准细胞生长曲线本次实验所用细胞系标准生长曲线见图1.

     2.2细胞形态学观察1 d 时，阳性对照组的部分细胞未贴壁，成悬浮的死细胞，已贴壁的细胞形态为圆形. 其余各组细胞几乎全部贴壁，折光性强，多为梭形和多角形，并见圆形分裂细胞. 3 d时阳性对照组的许多细胞胞体变小成圆形，核固缩，贴壁细胞聚集成团，为中毒形态. 其余组细胞形态正常，数量增多.  5 d时阳性对照组形态异常的细胞更多，可见部分死亡细胞，其余组细胞形态正常，密度更大. 7 d时阳性对照组可见大量死亡细胞，而其余组细胞形态正常生长旺盛，排列密集规则.
表1各材料组A值

    2.3受试金属细胞毒性分级通过A值细胞相对增殖率（Relative growth rte, RGR）. 计算公式为RGR=(实验组A值/空白组A值)×100%   然后根据GB/T16175?1996中的毒性评分标准转换成细胞毒性级别（表2）. 根据结果可以看出Ti?6Al?7Nb合金及纯钛在1, 3, 5, 7 d细胞毒性为0级. 阳性组细胞毒性为3~4级，Ti?6Al?4V合金细胞毒性为0~1级，表现出轻微的细胞毒性.  表2各材料组RGR与细胞毒性分级

    3讨论

    对于生物材料相容性的研究有许多种方法，其中最常用的是体外细胞培养法，它能直接观察细胞与生物材料复合生长的情况. 本实验我们选用了L?929鼠成纤维细胞，用MTT试验法对Ti?6Al?7Nb合金的细胞毒性进行评价. L?929小鼠成纤维细胞具有极强的生长增殖能力，对生长环境因素比较敏感. 作为非植入部位的细胞，可以充分反映出材料可能存在的毒性物质的反应［6］. MTT试验是通过对活细胞数量及其新陈代谢程度检测来对活细胞的代谢活性进行评价的一种方法. MTT是一种能接受氢原子的四唑盐染料，四唑盐化合物与活细胞作用后，活细胞线粒体上的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MIT还原成难溶性的蓝紫色结晶物、并沉积在细胞中. 二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中这种紫色结晶物，在一定量的细胞范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比. 因而测定MTT结晶形成量可间接反映细胞数量与活力，从而对该材料的细胞毒性作出可靠的定量评价［7］. 作为一种可用于口腔中的合金，Tamilselvi等［8］通过实验证明Ti?6Al?7Nb合金在模拟体液中具有良好的抗腐蚀性. 通过MTT试验的结果证明，Ti?6Al?7Nb合金和纯钛基本没有细胞毒性. 而Ti?6Al?4V合金由于有钒元素的存在，使L?929细胞的生长受到了一定的影响. 在A值上低于Ti?6Al?7Nb合金和纯钛. 由此可以看出Ti?6Al?7Nb合金较Ti?6Al?4V合金具有更好的生物相容性,在口腔用合金中具有广阔的前景.

【】
  ［1］ 姚滨南. 人工关节基本原理与材料［J］. 哈尔滨医学,2004,24(1):42-44.

［2］ Niinomi M. Recent research and development in titanium alloys for biomedical applications and healthcare goods［J］. Sci Technol Advan Mater, 2003,4:445-454.

［3］ 何宝明. 生物医用钛及其合金材料的开发应用进展、市场状况及问题分析［J］. 新材料产业,2003,7:23-28.

［4］ Okazaki Y, Nishimura E. Effect of metal released from Ti Alloy wear powder on cell viability［J］. Mater Transactions, 2000,41(9): 1247-1255.

［5］ Iijima D, Yomeyama T, Doi H. Wear properties of Ti and Ti?6Al?7Nb castings for dental prostheses ［J］. Biomaterials,2003,24:1519-1524.

［6］ 张玉梅，付涛，徐可为,等．含镧羟基磷灰石的细胞毒性研究［J］．牙体牙髓牙周病学杂志，2000,10(2)：152-154.

［7］ 吕晓迎，Kappert HF．牙科材料细胞毒性评价新方法(MTT试验)［J］．中华口腔医学杂志，1995,30：377-379.

［8］ Tamilselvi S, Raman V, Rajendran N. Corrosion behaviour of Ti?6Al?7Nb and Ti?6Al?4V ELI alloys in the simulated body fluid solution by electrochemical impedance spectroscopy［J］. Electrochimica Acta, 2006,52:839-846.