多房棘球绦虫混合重组BCG

【关键词】  多房棘球绦虫；重组BCG

　　Inhibition on apoptosis of splenocytes in mice immunized with mixed rBCGEmⅡ/3 and rBCGEm1433 vaccine against Echinococcus multilocularis

　　【Abstract】  AIM: To immunize mice with mixed rBCGEmⅡ/3 and rBCGEm1433 vaccine against  Echinococcus multilocularis(Em) and to investigate the apoptosis of spleen cells challenged with Em protoscoleces. METHODS:  Balb/c mice were vaccinated subcutaneously and intranasally with mixed rBCG vaccines respectively. Eighteen  weeks after challenged with Em protoscoleces the mice were killed to take the spleen. The spleen cells were isolated to measure apoptotic rate by  flow cytometry.  Blank vector, BCG and PBS served as controls. RESULTS: Apoptotic rate in the immunization group was lower than that in the PBS control group (P<0.01). CONCLUSION: Apoptosis of spleen cells in mice may be induced by infection with alveolar hydatid cyst, but it can be inhibited by immunization with mixed rBCGEmⅡ/3 and rBCGEm1433 vaccine.

　　【Keywords】 Echinococcus multilocularis; rBCGEmII/3 vaccine;   rBCGEm1433 vaccine; spleen/cytology; apoptosis

　　【摘要】 目的： 多房棘球绦虫混合重组BCGEmⅡ/3和BCGEm1433疫苗免疫小鼠并以Em原头节攻击后探讨以上疫苗对小鼠脾细胞凋亡的变化. 方法： 将混合重组BCG疫苗采用皮下注射和鼻腔内接种分别免疫Balb/c鼠8 wk后，用多房棘球绦虫原头节进行攻击感染，感染18 wk杀鼠取脾并分离脾细胞，流式细胞仪检测脾细胞的凋亡发生率，同时设有空载体、BCG和PBS对照. 结果： 疫苗接种组的脾细胞凋亡发生率明显低于感染对照组. 结论： 泡球蚴感染可引起小鼠脾细胞凋亡，而多房棘球绦虫混合重组BCGEmⅡ/3和BCGEm1433疫苗可在一定程度上抑制感染鼠脾细胞的凋亡.
 
　　【关键词】 多房棘球绦虫；重组BCGEmⅡ/3疫苗；重组BCGEm1433疫苗；脾/细胞学；细胞凋亡

　　0引言

　　Ameisen等［1］认为某些寄生虫感染诱导的凋亡在疾病的发病机制中起重要作用. 人们发现小鼠感染恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)或日本血吸虫(schistosoma japonicum) 以及大鼠感染卡氏肺孢子虫(pneumocystis carinii)后均可诱导其脾细胞发生凋亡［2-4］.
 　　
　　泡型包虫病(alveolar echinococcosis, AE)是由多房棘球绦虫(Echinococcus multilocularis, Em)的中绦期幼虫寄生在人体肝脏引起的一种严重危害人类健康的人畜共患寄生虫病. 当前分子生物学技术的为研制理想的Em疫苗提供了新方法，将Em外源DNA引入特定疫苗载体构建重组活疫苗可将保护性抗原传递至宿主免疫系统. 王昌源等［5］发现EmⅡ/3重组抗原（ELP蛋白）是一种有较好保护性免疫力的抗原分子. SilesLucas等［6］证实Em1433抗原位于Em原头蚴的生发层，其过度表达与原头蚴的进行性、侵入性和无限制生长特性有关，提示它是一种有希望的疫苗分子. Cirillo等［7］认为卡介苗（Bacille calmetteGuerin, BCG）是一种理想的疫苗载体. Matsuo等［8］在BCG中成功构建了外源抗原分泌系统，这为发展BCG成为多价疫苗载体打下了坚实的基础. 本实验我们在成功构建重组BCGEmⅡ/3和BCGEm1433疫苗的基础上［9-10］，等量混合以上两种疫苗作为混合疫苗免疫小鼠,原头节攻击免疫鼠并观察其脾细胞凋亡的情况，从而为研究该疫苗的保护性免疫机制提供有价值的实验数据.
 　　
　　1材料和方法

　　1.1材料65只雌性Balb/c小鼠，12～14周龄，体质量20～25 g，购自重庆医科大学实验动物中心；多房棘球绦虫重组BCGEmⅡ/3和BCGEm1433疫苗由本室构建［9-10］，将rBCGEmⅡ/3和rBCGEm1433疫苗按1∶1的浓度比例混匀，组成混合疫苗；ConA购自Sigma公司. Annexin VFITC试剂盒(LHK 601100)购自深圳晶美生物工程公司.
 
　　1.2方法

　　1.2.1实验分组65只雌性Balb/c小鼠随机分为5组，每组13只. 第1组为5×106 cfu混合疫苗悬浮于100 μL PBS于小鼠后背部皮下单次注射；第2组为5×105 cfu疫苗悬浮于10 μL PBS于小鼠鼻腔黏膜单次接种；第3组为5×106 cfu的空载体（含pBCG质粒的BCG）皮下单次注射对照组；第4组为5×106 cfu的BCG皮下单次注射对照组；第5组为100 μL PBS皮下单次注射对照.
 
　　1.2.2攻击感染多房棘球绦虫混合重组BCGEmⅡ/3和重组BCGEm1433疫苗免疫8 wk后用50个泡球蚴原头节腹腔内注射进行攻击. 对照组的攻击方案同免疫组.
 
　　1.2.3脾细胞制备攻击感染后18 wk剖杀各组小鼠，750 mL/L乙醇消毒、无菌取脾脏、匀浆、200目尼龙网过滤；灭菌双蒸水溶解红细胞后，用含100 mL/L灭活小牛血清的RPMI1640培养液调整细胞浓度为5×109/L，并加入青霉素1×105 U/L和链霉素1×105 U/L；台盼蓝染色后发现脾细胞存活率为93%～97%.
 
　　1.2.4脾细胞培养将分离的小鼠脾细胞加入24孔细胞培养板，每个标本设2孔，分别加入原液、10 mg/L ConA各1 mL, 37℃ 50 mL/L CO2培养12～16 h.
 
　　1.2.5Annexin VFITC染色法检测小鼠脾细胞凋亡培养12～16 h后，收集5×109/L脾细胞，用4℃预冷的PBS洗细胞两次，2500 r/min离心5 min；用250 μL结合缓冲液重新悬浮细胞，调节其浓度至1×109/L；取100 μL的细胞悬浮液加入5 mL流式细胞管中，加入Annexin VFITC 5 μL和20 mg/L碘化丙锭溶液10 μL；混匀后室温避光孵育15 min；在反应管中加400 μL PBS，用流式细胞仪(美国BectonDickinson公司)记录FITC标记的凋亡细胞在波长为495 nm紫外光激发下产生525 nm的绿色荧光以及PI标记的凋亡细胞和坏死细胞在波长为340 nm的紫外光激发下产生620 nm的红色荧光，用cellQuest软件分析细胞凋亡.
 
　　统计学处理： 各免疫组小鼠脾细胞凋亡发生率采用SPSS11.0软件进行分析，计量资料采用x±s表示，组间比较采用方差分析，组间两两比较用SNK法.

　　2结果

　　2.1原液组脾细胞凋亡当脾细胞不用任何刺激物时，5×106 cfu混合rBCG疫苗皮下注射免疫小鼠后，脾细胞凋亡发生率与PBS对照组相比降低（P<0.01）；5×105 cfu混合疫苗鼻腔内接种免疫小鼠后，脾细胞凋亡发生率低于PBS对照组（P<0.01）；皮下注射组的脾细胞凋亡发生率与鼻腔内接种组相比差异无统计学意义（P>0.05）；空载体和BCG皮下注射组的脾细胞凋亡发生率分别与PBS对照组相比无统计学差别（P>0.05，表1）.
 
　　表1重组BCGEmⅡ/3和BCGEm1433疫苗免疫，原头节攻击后小鼠脾细胞凋亡检测（略）

　　2.2ConA刺激组脾细胞凋亡变化当脾细胞用ConA刺激培养时，皮下注射组和鼻腔内接种组的脾细胞凋亡发生率低于PBS对照组（P<0.01）；鼻腔内接种组的脾细胞凋亡发生率低于皮下注射组（P<0.01）；空载体和BCG皮下注射组的脾细胞凋亡发生率分别与PBS对照组相比差异无统计学意义（P>0.05，表1）.
 
　　3讨论

　　碘化丙啶(propidium iodide, PI)是一种DNA染料，可特异性与DNA结合，但其不能透过细胞膜. 由于凋亡细胞的膜通透性增加，因此可着染PI. 当用荧光激活细胞分检器（fluorescence activated cell sorter, FACS）检测时，着染PI的凋亡细胞在一定压力下，通过壳液包围的进样管进入流动室，排成单列细胞，经流动室的喷嘴喷出形成细胞液流. 在波长为340 nm紫外光激发下产生波长为620 nm的红色荧光信号，经过机处理形成荧光直方图. 凋亡细胞信号出现于亚G1蜂上，但只代表G0/G1期发生凋亡的细胞，而不能检测S期和G2期发生凋亡的细胞；在单细胞悬液制备过程中，易产生大量细胞碎片，晚期凋亡细胞经洗涤处理可引起胞内DNA丢失，造成亚G1峰前移，与碎片峰融合在一起，因而不能区分凋亡细胞和碎片；同时坏死细胞也可着染PI，因此也不能区分凋亡细胞和坏死细胞. Annexin VFITC染色法可弥补PI染色法的不足，早期凋亡细胞因细胞膜的磷脂对称性改变而使磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine, PS）暴露于细胞外，PS可特异结合标记有异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)的连接素V（annexin V）；标记FITC的凋亡细胞在波长为495 nm紫外光激发下产生525 nm的绿色荧光，标记PI的凋亡细胞和坏死细胞在波长为340 nm的紫外光激发下产生620 nm的红色荧光，经过计算机处理形成DNA二维图. 可见Annexin VFITC染色法不仅可以区分凋亡细胞（绿色）与坏死细胞（红色），而且可检测DNA含量（红色），因此Annexin VFITC染色法是研究细胞凋亡的一种较理想方法.
 
　　李富荣等［11］将正常Balb/c鼠脾CD4+T淋巴细胞用EmAg刺激培养16 h后，用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(terminal deoxynucleotidyl transeferasemediated dUTP nick end labeling, TUNEL)检测其凋亡发生率为0.92%，而小鼠感染泡球蚴12 wk和25 wk时凋亡发生率为4.29%和34.72%. 本实验结果显示小鼠感染泡球蚴18 wk时，用Annexin VFITC染色法检测脾细胞凋亡发生率为16.92%～21.35%，类似上述结果，提示泡球蚴感染可诱导小鼠脾细胞发生凋亡，推测泡球蚴抗原经抗原提呈细胞加工处理后，形成13～17个氨基酸残基组成的抗原肽，该肽与MHC分子连接形成抗原肽MHC分子复合物，经高尔基体运送到APC表面，与小鼠脾细胞TCR/CD3复合物结合后，诱导胞内Fas/Apo1/CD95及其配体FasL表达，导致脾细胞凋亡［12］，此过程称激活诱导的凋亡（activationinduced cell death, AICD）.
 
　　Kremer等［13］证实BCG接种可抑制人外周血单核细胞发生凋亡. 本文发现BCG和空载体皮下注射组小鼠脾细胞凋亡发生率轻微低于感染对照组，表明BCG免疫对泡球蚴感染鼠脾细胞凋亡具有一定的抑制作用.
 　　
　　本实验结果显示皮下注射组和鼻腔内接种组小鼠脾细胞凋亡发生率显著低于感染对照组，提示疫苗接种可抑制泡球蚴感染鼠脾细胞发生凋亡，推测混合重组BCGEmⅡ/3和 BCGEm1433疫苗免疫小鼠后可激活体内的免疫细胞，促进其分泌免疫效应分子，这些免疫细胞与免疫效应分子互相促进和互相调节，抑制泡球蚴感染鼠脾细胞发生凋亡，使小鼠脾细胞数目相对增加，从而加强小鼠抗泡球蚴感染的保护性免疫反应.
 
　　【】

　　［1］ Ameisen JC, Estaquier J, Idziorek T. From AIDS to parasite infection: pathogenmediated subversion of programmed cell death as a mechanism for immune dysregulation［J］. Immunol Rev, 1994,142(1):9-51.

　　［2］ ToureBalde A Sarthou JL, Aribot G, et al. Plasmodium falciparum induces apoptosis in human mononuclear cells［J］. Infect Immun, 1996,64(3):744-750.

　　［3］ 李文桂,石佑恩. 血吸虫重组BCGSj26GST疫苗免疫对CD4+T细胞凋亡的影响［J］. 免疫学杂志,2000,16(专刊):10-13.

　　［4］ 李文桂,陈雅棠,刘成伟. 双氢青蒿素对卡氏肺孢子虫肺炎大鼠脾细胞凋亡的影响［J］. 中国人兽共患病杂志,2003,19(2):55-59.

　　［5］ 王昌源,陈雅棠,余登高,等. 多房棘球绦虫ELP重组蛋白疫苗免疫Balb/c小鼠引起的免疫应答［J］.免疫学杂志,2003,19(4):285-288,292.

　　［6］ SilesLucas M, Felleisen RS, Hemphill A, et al. Stagespecific expression of the 1433 gene in Echinococcus multiloculris［J］. Mol Biochem Parasitol, 1998,91(2):281-293.

　　［7］ Cirillo JD, Stover CK, Bloom BR, et al. Bacterial vaccine vectors and bacillus calmetteGuerin［J］. Clin Infect Dis, 1995,20(4):1001-1009.

　　［8］ Matsuo K, Yamaguchi R, Yamazaki A, et al. Establishment of a foreign antigen secretion system in mycobacteria［J］. Infect Immun, 1990,58(12):4049-4054.

　　［9］ 李文桂,王鸿,朱佑明. 多房棘球绦虫重组BCGEmII/3疫苗构建及其表达效率［J］.中国地方病学杂志,2006,25(5):490-493.

　　［10］王鸿,李文桂. 多房棘球绦虫重组BCGEm1433II/3疫苗的构建及鉴定［J］. 中国病原生物学杂志,2006,1(1):43-46.

　　［11］ 李富荣,石佑恩,史大中,等. 泡球蚴感染过程中宿主CD4+T细胞凋亡和凋亡相关基因转录水平的研究［J］. 中国人兽共患病杂志,2003,19(4):59-65.

　　［12］ 姚希,沈丽佳,殷操,等. 口腔扁平苔藓中Caspase3, TNFα和TNFαRI的表达及与细胞凋亡的关系［J］. 第四军医大学学报,2006,27(7):580583.

　　［13］ Kremer L, Estaquier J, Brandt E, et al. Mytobacterium bovis bacillus Calmette guerin infection prevents apoptosis of resting human monocytes［J］. Eur J Immunol, 1997,27(9):2450-2456.