藜草花粉变应原免疫活性分析

                 作者：张洁，孙秀珍，陈曦，冯向莉，刘艳琴

【关键词】  哮喘；藜草；花粉；变应原；变应原性；免疫原性

　　Immunoactivity analysis of album pollen allergen

　　【Abstract】 AIM: To analyse  protein components in album pollen and evaluate their allergenicity and immunogenicity. METHODS: The components of protein allergen were collected from the crude extract of chenopodium album pollen with Sephacryl S200 HR gel filtration for removing the impurities. Molecular weights of the components were tested through SDSPAGE. Then the reaction rates of IgE and IgG in  asthmatic patients serum to chenopodium album pollen were counted by immunoblotting.  RESULTS: Twelve bands of protein were obtained through SDSPAGE. The molecular weight of each band was 92, 63.1, 61, 52, 45, 43, 39.7, 38.9, 34, 31.6, 28.4 and 18.5~12 ku. Immunobloting identified 4 protein bands recognized by sIgE,  molecular weights being 92, 34, 31.6 and 18.5~12 ku, which reacted with 70%, 50%, 80% and 90% of asthmatic patient serum. Eight protein bands with molecular weights being 92, 61, 52, 45, 43, 39.7, 31.6 and 18.5~12 ku showed sIgG binding capacity, which reacted with 80%, 40%, 10%, 20%, 80%, 10%, 10% and 100% of asthmatic patient serum.  CONCLUSION: Album pollen comprises 12 major protein components. Components with strong allergenicity and immunogenicity are the proteins with molecular weight of 18.5~12 and 92 ku. Proteins with molecular weight of 34 and 31.6 ku have  strong allergenicity, and  weak immunogenicity or not. Proteins with molecular weight of  61,43,45,52 and 39.7 ku possess  certain immunogenicity,  but no  allergenicity.

　　【Keywords】 asthma; chenopodium album;  pollen; allergens; allergenicity; immunogenicity

　　【摘要】 目的： 分析藜草花粉变应原成分及其变应原性、免疫原性. 方法： 用Sephacryl S200HR葡聚糖凝胶层析法分离、纯化藜草花粉变应原,通过十二烷硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电脉法(SDSPAGE)测定变应原各组分的分子质量；应用免疫印迹法检测各组分蛋白质与藜草花粉过敏性哮喘患者血清中sIgG和sIgE的反应率. 结果： 藜草花粉经电泳后得到12条蛋白质区带,分子质量依次为92, 63.1, 61, 52, 45, 43, 39.7, 38.9, 34, 31.6, 28.4和18.5~12 ku；免疫印迹可见4条sIgE反应带,蛋白分子质量依次为92, 34, 31.6和18.5~12 ku；与患者血清反应率分别是70%, 50%, 80%和90%；与血清sIgG结合的反应带有8条,蛋白分子质量为92, 61, 52, 45, 43, 39.7, 31.6和18.5~12 ku；与患者血清反应率分别是80%, 40%, 10%, 20%, 80%, 10%, 10%和100%. 结论： 藜草花粉变应原主要含12种蛋白质成分,其中分子质量为18.5~12 ku和92 ku的蛋白质变应原活性及免疫原活性均很强,是主要变应原成分；分子质量在34和31.6 ku的蛋白质有较强的变应原性而无或仅有较弱的免疫原性；而分子质量为43, 61, 45, 52和39.7 ku的蛋白质具有一定的免疫原性而无变应原性.
 
　　【关键词】 哮喘；藜草；花粉；变应原；变应原性；免疫原性

　　0引言

　　从气传致敏花粉种类调查中发现,藜草是我国许多地方夏秋季节大气中最常见的气传致敏花粉之一［1］. 我们采用SDSPAGE分析藜草花粉变应原的蛋白成分,并用免疫印迹的方法,通过观察藜草花粉过敏性哮喘患者的血清结合模式,分析藜草花粉各蛋白成分的变应原性及免疫原性,为藜草花粉变应原的纯化、重组打下基础.
 
　　1材料和方法

　　1.1材料

　　1.1.1对象自我院变态反应专科门诊患者中选择藜草花粉过敏性哮喘患者10（男4,女6）例,年龄1456(平均34.1±13.7)岁. 支气管哮喘诊断标准依据第四届全国哮喘学术会议制定的《支气管哮喘防治指南》［2］. 藜草花粉过敏的筛选标准：根据典型的花粉过敏病史；藜草花粉变应原皮肤点刺试验［3］结果≥(一般皮丘≥1.5 cm,红斑＞1.0 cm). CAP系统检测哮喘患者血清藜草花粉特异性IgE(sIgE)阳性.
 
　　1.1.2试剂及仪器试剂： 藜草花粉体内诊断点刺液（德国默克阿罗格）,SephacrylS200HR葡聚糖凝胶（Amersham Pharmacia Biotech AB）,低分子标准蛋白(上海丽珠东风生物技术有限公司),兔抗人IgGHRP及IgEHRP(丹麦DAKO公司). 仪器：HDJ8043核酸蛋白监测仪（江苏兴化市化学分析仪器厂）, POWER PAC200电泳仪，MiniPROTEANⅡCell电泳槽(美国BIORAD公司).
 
　　1.2方法

　　1.2.1血清标本采集及处理常规静脉取血3 mL,室温下以2000 r/min×15 min,离心后将血清移至另一试管中,在-20℃冰箱保存备用.

　　1.2.2藜草花粉粗浸液的制备［4］用脱落法采集当地藜草花粉,过筛除杂质室温下乙醚脱脂. 取脱脂花粉10 g加Cocas液200 mL,用超声粉碎机粉碎、提取、减压过滤. 提取液以PBS液透析24 h,自然蒸发浓缩.
 
　　1.2.3藜草花粉变应原的分离称取Sephacryl S200HR葡聚糖凝胶10 g,用0.04 mol/L, pH 7.4的磷酸盐缓冲液（PBS）250 mL溶胀. 将糊状的Sephacryl S200HR凝胶一次倾入1.6 cm×60 cm洁净层析柱中使之自然沉降,待凝胶沉积后,用2~3倍柱床体积的PBS平衡层析柱. 将浓缩的花粉粗制液3 mL离心（10 000 g/min×10 min）后加入凝胶柱里,连接恒流泵,以30 mL/h的流速用PBS洗脱层析柱,并以6 min/tub分管收集洗脱液. 用核酸蛋白监测仪监控洗脱情况,得洗脱曲线,有3个洗脱峰（S200P1, P2, P3）. 后两峰为无色液体,蛋白含量少,弃之. 将前一峰洗脱液收集,经浓缩、透析、离心（10 000 g/min×10 min）,冰箱冷存备用.　　
　　1.2.4SDSPAGE检测各组分蛋白质分子质量区带 取标准蛋白、粗制液、洗脱峰（S200P1）各40 μL,进行SDSPAGE. 采用不连续PAGE,分离凝胶浓度125 mL/L,浓缩胶浓度50 mL/L,电极缓冲液pH 8.3. 电泳在室温中进行,电压为150 V,染料迁移至凝胶下端约1 cm处停止电泳. 将凝胶片取出染色1 h,倾出染色液,用蒸馏水洗凝胶数次后加入脱色液,数小时换液一次,直到背景清晰. 选用分子质量已知的标准蛋白［5］（兔磷酸化酶97.4 ku,牛血清白蛋白66.2  ku,兔肌动蛋白43.0 ku,牛碳酸酐酶31.0 ku,胰蛋白酶抑制剂20.1 ku,鸡蛋清溶菌酶14.4 ku）作标记物,与待检样品同一条件下电泳. 测量标准蛋白迁移距离,迁移率(迁移距离/总距离),以它为横坐标,标准蛋白分子质量的对数为纵坐标,可得到一条标准曲线,根据待测蛋白的迁移距离,从标准线上可求得其分子质量.
 
　　1.2.5电泳转印切取与电泳凝胶相同大小的聚乙烯二氟膜(PVDF膜),用电转移缓冲液润湿,放在电泳后的凝胶上,用润湿的Whatman 3 mm滤纸支持；用另一块润湿的滤纸贴在凝胶的另一面,形成一套夹心的“三明治”. 将“三明治“置于两块充分浸润的碳板之间,PVDF膜朝向阳极,接通恒流电源,电流20 Ma,转印2 h,取出PVDF膜夹在两张干燥的滤纸之间干燥.
 
　　1.2.6血清免疫印迹检测将PVDF膜切成2 mm宽的条带,置于转移槽中. 用PBS缓冲液冲洗10 min,加入30 mL/L脱脂奶粉封闭,摇床摇约1 h. 再用PBS缓冲液洗3次,每次5 min,然后加入10例藜草花粉过敏的患者血清样本,室温下摇动2 h. 用PBS缓冲液洗3次后,分别加入兔抗人IgGHRP、兔抗人IgEHRP,室温摇动1 h. 再用PBS缓冲液洗3次,加入底物溶液反应至抗原区带显色后终止反应,将PVDF膜夹在滤纸中干燥,成像后暗处保存.

　　2.1藜草花粉变应原经SDSPAGE藜草花粉变应原浸液蛋白电泳经考马斯亮蓝染色清晰地显示出12条区带,各区带蛋白分子质量依次为92, 63.1, 61, 52, 45, 43, 39.7, 38.9, 34, 31.6, 28.4和18.5~12 ku,其中分子质量在18.5~12 ku 的蛋白带宽、色深,含量最丰富(图1).

　　图1藜草花粉变应原浸液SDSPAGE分析　略

　　2.2免疫印迹以兔抗人IgEHRP为二抗体,10例患者血清免疫印迹检测均为阳性,可见4条反应带,分子质量依次为92, 34, 31.6和18.5~12 ku；分别与70%, 50%, 80%和90%的患者血清sIgE结合(图2). 以兔抗人IgGHRP为二抗体,10例患者血清免疫印迹检测均为阳性,可见8条反应带,分子质量依次为92, 61, 52, 45, 43, 39.7, 31.6和18.5~12 ku；分别与80%, 40%, 10%, 20%, 80%, 10%, 10%和100%的患者血清特异性IgG(sIgG)结合(图2).

　　图2免疫印迹分析　略

　　3讨论

　　藜草,一年生藜科草本植物,属风媒花粉,授粉高峰期为7~9月,是我国夏秋季节重要的吸入性致敏原. 花粉成分中除了含有250 ml/L的水分外,还含有多糖、脂肪、蛋白质和多肽. 这些成分都能致敏,但其中最主要的致敏抗原成分为蛋白质. 藜草花粉变应原经Sephacryl S200HR凝胶层析后通过SDSPAGE清晰显示了12条电泳区带, 蛋白质分子质量为92~12 ku. 其中分子质量在18.5~12 ku的蛋白质区带色深且宽,含量最丰富. 可见藜草花粉变应原至少有12种蛋白质成份,分子质量为18.5~12 ku的蛋白质占优势.
     
　　致敏花粉免疫学特性是指花粉的变应原性和免疫原性. 变应原性指抗原刺激机体产生特异性IgE抗体的能力；而免疫原性是指抗原诱导机体产生IgG型抗体的特性［6］. 本研究发现藜草花粉变应原中有些成分兼有变应原性和免疫原性. 分子质量在18.5~12 ku的蛋白质可被90%患者血清IgE识别, 血清IgG的结合率达100%. 虽然100%的血清IgG结合率与样本的大小等因素有关,但这足以说明18.5~12 ku的蛋白质具有极强的免疫原活性和变应原活性. 分子质量为92 ku的蛋白质含量丰富,它与70%患者血清IgE结合,又与80%血清IgG结合,说明92 ku的蛋白质也具有很强的免疫原活性和变应原活性. 分子质量为43 ku的蛋白质有较强的免疫原性而无变应原性,可被80%的患者血清IgG所识别而与血清IgE无反应. 分子质量为61, 45, 52, 39.7, 31.6 ku的蛋白质免疫原性较弱,只被40%, 20%, 10%, 10%和10%的患者血清IgG结合,且除31.6 ku蛋白质外,均无变应原性. 分子质量为31.6 ku和34 ku的蛋白质具有较强的变应原活性,与患者血清IgE的反应率分别是80%和50%. 分子质量63.1, 38.9和28.4 ku的蛋白质从哮喘患者血清IgE和IgG结合模式来看,既无变应原活性也无免疫原活性.
     
　　研究证实,哮喘患者血清中IgE增高,IgE介导的Ⅰ型超敏反应是速发型哮喘的主要发病机制. 藜草花粉变应原中分子质量为92, 43, 31.6和18.5~12 ku的蛋白质可能是引发藜草花粉过敏性哮喘的主要变应原成分. IgG可以介导Ⅱ型、Ⅲ型和部分Ⅰ型超敏反应,是哮喘病程中机体产生的保护性抗体,也是抗原特异性免疫疗法(AIT)［7］中产生的特异性阻滞型抗体.
 
　　藜草花粉变应原中具有免疫学活性的成分可介导机体产生IgG,对藜草花粉过敏患者的AIT有很大意义.  Etievant等［8］在屋尘螨脱敏的哮喘患者中发现IgG4降低者症状缓解,Nahm等测定尘螨过敏性哮喘患者血清中IgG亚类,发现当IgG4升高时,可诱发哮喘发作；而IgG4是由变应原中具有免疫活性的成分诱导产生,所以藜草花粉变应原中具有免疫学活性的蛋白质92, 61, 52, 45, 43, 39.7, 31.6和18.5~12 ku能够诱导哮喘AIT中特异性保护性抗体的产生,而且又有可能诱导哮喘发作. 其中具有强免疫活性的蛋白质92, 43和18.5~12 ku与患者血清IgG的反应率均大于50%,是藜草花粉变应原中具有免疫活性的主要变应原. 61, 52, 45, 39.7和31.6 ku蛋白质与患者血清IgG的反应率均小于50%,是具有免疫活性的次要变应原成分.
     
　　藜草花粉变应原中既有变应原性和免疫原性的蛋白质为92, 31.6和18.5~12 ku. 它们即可以诱发哮喘又可以诱导AIT中保护性抗体的产生. 而分子质量为63.1, 38.9和28.4 ku的蛋白质既无变应原性又无免疫原性,与哮喘的发生及AIT关系不大.
     
　　研究藜草花粉变应原的免疫活性是粗制藜草花粉变应原浸液重组抗原从而提高哮喘特异性诊断、AIT水平的基础. 若重组藜草花粉变应原用于哮喘诊断时，分子质量34 ku的蛋白应入选；用于AIT时，分子质量43 ku的蛋白应入选，变应原性和/或免疫原性较弱或无的蛋白，从理论上讲对哮喘诊治意义不大，重组变应原时可筛除.

　　【】

　　［1］ 叶世泰. 气传致敏花粉调查［M］. 北京: 北京出版社,1991:29.

　　［2］ 中华医学会呼吸病学分会哮喘学组. 支气管哮喘防治指南（支气管哮喘的定义、诊断、治疗及和管理方案）［J］. 中华结核和呼吸杂志,2003,26(3):3.

　　［3］  Ipsen H, Klysner SS, Marsen JN, et al. Allergenic extracts［A］//Milddleton Jt. E, Reed CE, llis EF, et al, Allergy Principle and Practice.4th ed［M］. St,Louis:Mosby,  1993:529.

　　［4］　叶世泰. 变态反应学［M］. 北京: 出版社,1998:81,326.

　　［5］  鄂征. 组织培养和分子细胞学技术［M］. 北京: 北京出版社,1995:286.

　　［6］  Nakada S. Allergenicity and immunogenic components of house dustmite Derma to phagoidesfarine ［J］. Ann Allergy, 1986,56(2):150-155.

　　［7］  Bousquet J. Specific immunotherapy in asthma［J］. Allergy, 1999,54:37-38.

　　［8］  Nahm DH. Seasonal variation of IgG sub class antibodies to houseDust mite in ser a from mitesensitive asthma tic patients ［J］. Ann Allergy Asthma Immunol, 1998,80(5):411-415.