江苏地区不同类型乙型肝炎患者HBV基因分型研究
【关键词】 肝炎病毒,乙型；基因型；聚合酶链反应
HBV genotyping in hepatitis B patients in Jiangsu province
【Abstract】 AIM: To investigate the distribution of hepatitis B virus (HBV) genotypes of hepatitis B patients in Jiangsu province and analyze the relationship of HBV genotypes with the serum HBV DNA levels of patients. METHODS: The HBV genotypes and HBV DNA levels of 176 patients in Jiangsu province were detected by realtime quantitative PCR and Taqman MGB probe technology.RESULTS: Among 176 HBVinfected patients, the proportions of genotype C, BC mixedtype, B, A and D were 66.5%(117/176), 22.7%(40/176), 5.1%(9/176), 0.6%(1/176) and 0.6%(1/176), respectively. The results showed there were significant differences between genotype C and genotype BC mixedtype in HBV DNA load(P<0.05), and the HBV DNA level of genotype BC mixedtype was significantly higher than that of genotype C. The rate of genotype C among the patients of chronic hepatitis B was 71.4%, higher than that among the patients of acute hepatitis B, liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma, but it showed no significant differences in the various clinical types of HBV infection tested(P>0.05). CONCLUSION: Genotype C and genotype BC mixedtype are the two dominant genotypes in the patients in Jiangsu province, and genotype B, A, and D are also found, but not common. The HBV DNA load of genotype B, C mixedtype is significantly higher than that of genotype C.
【Keywords】 Hepatitis B Virus; Genotype; polymerase chain reaction
【摘要】 目的： 了解江苏地区乙型肝炎病毒基因型分布特征，探讨HBV各基因型与血清HBV DNA水平的关系. 方法：采用荧光定量PCR结合Taqman MGB探针技术，对江苏地区176份乙型肝炎患者血清中的HBV DNA进行基因分型和定量检测. 结果：176例血清中，C型117人（66.5%），B, C型40人（22.7%），B型9人（5.1%），D型1人（0.6%），A型1人(0.6%). C型与B, C混合型在HBV DNA水平上存在统计学差异（P<0.05），B, C混合型的HBV DNA水平明显高于C型. C基因型在慢性乙型肝炎患者中的所占比例（71.4%）比在急性乙型肝炎、肝硬化和肝癌患者中所占的比例较高，但差异无统计学意义. 结论： 江苏地区HBV基因型以C型为主, B, C混合型次之，B型较少，D型,A型极少；B, C混合型患者的HBV DNA数量水平高于C型.
【关键词】 肝炎病毒，乙型；基因型；聚合酶链反应
0引言
乙型肝炎病毒(HBV)为一双链DNA病毒，主要引起急、慢性肝炎、肝硬化和肝癌，其基因序列高度变异，目前HBV已分为A～H 8种基因型［1］，HBV基因型呈一定的地域性分布. 国外研究发现，HBV基因型与临床表现、预后、应答均有一定关系，不同基因型具有不同的致病性，HBV基因型与肝癌发生率也存在一定相关性，HBV DNA水平与其基因型之间有无关系存在争议. 国内研究多集中在研究某地区乙型肝炎患者HBV基因型的组成与分布上，关于HBV基因型与HBV DNA水平、肝病严重程度等之间的关系等方面的研究还比较少，研究结果也多存在争议. 本研究采用荧光定量PCR结合Taqman MGB探针技术，对江苏淮安地区176例乙型肝炎患者进行HBV基因分型和HBV DNA定量检测，探讨HBV各基因型与血清HBV DNA水平的关系.
1材料和方法
1.1材料176份HBV感染血清均于200509/200602采自江苏省淮安市第四人民门诊和住院患者，其中急性乙型肝炎19例，慢性乙型肝炎119例，肝硬化及肝癌38例. 其中，男性134例，女性42例，年龄10～77（平均年龄37.5）岁，诊断标准符合2000年第十次全国传染病与寄生虫病学会和肝病学分会联合修订的病毒性肝炎防治方案［2］. GeneAmpR5700 Sequence Detection System为美国PE公司产品. HBV基因分型荧光PCR检测试剂盒，由杭州博赛基因诊断技术有限公司提供； HBVPCR荧光定量检测试剂盒由上海复星医学科技有限公司提供，检测灵敏度为4.2×102 IU/L.
1.2方法
1.2.1HBV DNA定量检测HBV DNA浓度测定采用荧光定量PCR法，HBV DNA提取按操作说明.
1.2.2HBV DNA基因分型检测血清标本50 μL加核酸提取液50 μL，振荡10 s. 100℃干浴10 min，14593 g离心10 min，上清液即可用作PCR反应的模板. 基因扩增时，取上清液4 μL分别加入含有36.4 μL各型基因型混合液的反应管中，混匀，14593 g离心数秒，反应管置于5700定量荧光仪上，反应条件为37℃×2 min，94℃×2 min；再按94℃×10 s→62℃×40 s，循环40次，荧光检测在62℃，荧光通道检测选择FAM.
统计学处理： 计量数据以x±s表示，组间比较采用方差分析及LSDt检验. 计数资料组间比较采用χ2检验.
2结果
2.1176例患者的HBV基因分型及其分布对江苏地区176例不同临床类型的HBV患者进行基因分型，本研究检测到5种类型的基因型，构成比由高到低依次为：C型66.5%（117/176），B， C混合型22.7%（40/176），B型5.1%（9/176），A型0.6%（1/176），D型0.6%（1/176），无法分型4.5%（8/176）. 因此，C型和B, C混合型是该地区HBV的优势基因型，B型较少，A型和D型都只检测到1例，没有发现E, G, H等基因型. 慢性乙型肝炎患者中的HBV基因型与急性乙型肝炎、肝硬化或肝癌患者中的相比，C基因型所占比例较高（71.4%），但经χ2检验，差异无统计学意义（P>0.05）.
表1乙型肝炎病毒基因分型检测结果及分布（略）
2.2HBV基因型与HBV DNA数量水平的关系176份急性乙型肝炎、慢性乙型肝炎、肝硬化、肝癌患者血清中HBV DNA含量在2.01×103～8.97×109 IU/mL之间，均值为7.96×106 IU/mL；HBV各基因型与其DNA数量水平如表2所示. 经分析，C型与B,C混合型在HBV DNA水平上存在统计学差异（P<0.05），B, C混合型的HBV DNA水平明显高于C型. C型与B型（P>0.05）,B型与B, C混合型患者（P>0.05）的HBV DNA水平没有统计学差异. 无法分型的8例样本的HBV DNA水平为（3.53±0.46） log10IU/mL，定量值均低于1.0×104 IU/mL，可能因其浓度较低，不适宜做乙肝病毒基因型的测定.
表2HBV基因型与DNA数量水平的关系（略）
注： 因A型、D型只有1例，用其HBV DNA数量表示.
3讨论
既往流行病学调查表明HBV基因型呈一定的地理区域分布，我国主要以HBV C型和B型感染为主，也存在A型、D型及B和C型混合感染. 目前认为，不同地区优势基因型反映了HBV感染史发生的变异特点，是病毒变异后进化的结果. 肖扬、周岳进等［3］对浙江温州地区966例患者HBV分型研究显示，66.46%为C型，20.49%为B型，B, C混合型为11.08%. 李雅娟等［4］对北京、长春、汉川、深圳、清远和南京等6个城市的445例HBV感染者进行研究发现，53.7%为C型、32.6%为B型，13.7%为B和C型混合感染，未发现有D型. 谢秀琴等［5］对江苏地区128例乙肝患者分型研究结果显示，该地区主要以C型（61.72%）和B型（37.5%）为主，仅发现1例B、C混合型（0.78%）. 由上可知，本研究对于江苏地区乙肝患者HBV分型的结果与国内其他学者的结果基本一致，但是B, C混合型所占的比例较大、B型所占的比例较小，还存在有A型、D型感染，与以往的研究结果存在差异，这可能由于样本差异及实验方法不同所致.
国内外众多研究发现，HBV基因型与临床表现、预后、应答均有一定关系，不同基因型具有不同的致病性. 葛宪民等［6］和学者Kao等［7］的研究结果提示，随着疾病严重程度的增加，C型所占的比例升高，而B型所占比例降低，C型与较为严重的肝脏疾病有关. 本研究表明，慢性乙型肝炎、肝硬化和肝癌患者主要为C型感染为主、其次为B, C混合型，B型很少. C基因型在慢性乙型肝炎患者中的所占比例（71.4%）比在急性乙型肝炎、肝硬化和肝癌患者中所占的比例较高，但差异无统计学意义（P>0.05）.
目前认为，乙肝发病机制是HBV病毒诱导的免疫反应，而血清中高滴度的HBV是乙肝发病的危险因素之一，HBV的复制状态与其基因型之间有无关系存在争议. Kao等［8］研究发现C基因型患者的HBV DNA水平明显高于B型患者；谢琴秀等［5］和李朝霞等［9］的研究结果显示B型, C型HBV DNA水平差异无统计学意义（P>0.05）. 而本研究显示C型与B型（P>0.05）, B型与B, C混合型（P>0.05）在HBV DNA水平上没有明显差异，但C型与B, C混合型患者的HBV DNA水平有显著差异（P<0.05），B, C混合型患者的HBV DNA数量明显高于C型，表明B, C混合型患者体内HBV处于较高复制水平，这可能也是导致B, C混合型乙肝患者的预后极差的原因之一.
HBV DNA基因分型与HBV病毒复制、临床演变及治疗反应相关，每个地区的主要基因型以及HBV的基因型地理分布与HBV感染的地方流行性有关. 因此，HBV基因型正成为21世纪HBV研究的热点，同时研究乙型肝炎患者HBV DNA的基因型对于了解病毒感染后形成的不同临床表现以及对抗病毒药物的治疗效果亦具有重要的意义. 报道，干扰素对B基因型的疗效优于C基因型［10］，而另有报道，拉米夫定对C基因型的远期疗效明显优于B基因型［11］，这对临床合理用药具有重要的指导意义. 随着对基因分型方法学研究的不断深入，基因型分析将会对乙肝的诊断、抗病毒治疗、预后判断有着积极的作用.
【文献】
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［4］ 李雅娟,庄辉,李杰,等. 乙型肝炎病毒感染者病毒基因型和亚型分布及其临床意义［J］. 中华肝脏病杂志,2005,13(10):724-729.
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