脆弱类杆菌荧光定量PCR法检测

【关键词】  脆弱类杆菌；荧光定量PCR；SYBR,Green,I

　　　摘要： 目的   探讨荧光定量PCR技术检测脆弱类杆菌。方法   用特异性引物和荧光染料实时PCR扩增并检测产物。结果   脆弱类杆菌标准株(ATCC 25285)和4株分离株均有特异扩增曲线，灵敏度达 102个菌；而大肠埃希菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌无特异扩增曲线。结论   荧光染料实时PCR技术可特异并定量检测脆弱类杆菌

　　关键词： 脆弱类杆菌；荧光定量PCR；SYBR Green I

　　Detection bacteria fragile by SYBR Green real-time PCR  

　　Abstract： Objective   To identify the bacteria fragiles(B.fragiles)by 16S target rRNA realtime PCR.Methods   A pair of specific primers was designed.The PCR products were detected by fluorescent quantificative realtime PCR.Results   The B.fragilis ATCC 25285 and 4 separative strains of B.fragilis appeared in the special amplification product curve,while E.coli,L.bulgaricus and S.thermophilus did not.The flourescent qantificative PCR can detect 102 bacteria.Conclusion   16S rRNAtargeted primer and fluorescent quantifive realtime PCR can be applicable for the identification and quantification of B.fragilis.

　　Key words：bacteria fragile;fluorescent quatititive PCR;SYBR Green I
     
　　脆弱类杆菌是G-性无芽孢厌氧菌中最常见临床分离株，常规厌氧培养分离需2～7d，不能及时指导临床辨别病原菌。细菌分子生物学技术的为检测细菌感染提供了早期特异敏感的检测方法〔1〕。本文采用荧光定量PCR检测脆弱类杆菌的16S rRNA基因。结果报告如下。

　　1   材料与方法

　　11   材料

　　111   菌株与培养   脆弱类杆菌ATCC 25285（复旦大学医学院）；脆弱类杆菌临床分离株4株，选用拟杆菌（Bd）培养基厌氧培养鉴定；保加利亚乳杆菌CICC 6047、嗜热链球菌CICC 6038、大肠埃希菌ATCC 25922各1株，选用双歧杆菌（BL）培养基培养。

　　112   仪器与试剂   定量PCR扩增仪及配套分析软件（Gene Amp 5700,美国Perkin-Elmer公司），离心机；细菌基因组提取试剂盒、Ex Taq DNA聚合酶、10×缓冲液、SYBR Premix Ex TaqTM（perfect Real-time）荧光染料〔TakaRa宝生物工程（大连）有限公司〕。

　　12   方法

　　121   引物设计   在16S rRNA 序列中第831-864位点和982-1007位点，通过分析软件Blast(http://wwwncbinlmnihgov)同GenBank中大肠埃希菌等基因序列相比较，参照〔2〕设计特异性引物。正向引物：F:5′-gaaagcattaagtattccacctg-3′；反向引物：R:5′-cggtgattggtcactgaca-3′，由TakaRa宝生物工程（大连）有限公司合成。

　　122   特异性测定   分别取不同试验菌增菌培养液，按提取试剂盒说明书进行细菌基因提取，使每1μl提取液中含有106个细菌的DNA，进行荧光定量PCR。

　　123   灵敏度测定   将标准株菌液计数为109/ml，倍比稀释使每1μl提取液中含有107,106,105,104,103,102,10,1个细菌的DNA，进行荧光定量PCR。扩增产物的融解曲线用配套分析软件中的Dissociation Protocol程序制图和分析。

　　124   SYBR Green Ⅰ嵌和荧光染料实时PCR反应体系及条件   10×Buffer（含SYBRGreen染料Mg2+ dNTP Taq酶）5μl；正反向引物各02μl（10μmol）；待检样品1μl，加水34μl混匀后，按95℃ 10s，95℃ 5s，60℃ 34s，共进行40个循环。

　　2   结果

　　21   特异性   PCR结果显示，5株脆弱类杆菌均有特异扩增曲线，而大肠埃希菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌无特异扩增曲线。

　　22   灵敏度（图1）   图1可见，荧光信号强度（Rn）维持在基线（0对应的横线）上，15个循环后，Rn开始上升。107，106，105的扩增曲线在30个循环后到平台期，104,103,102的扩增曲线在38～40个循环时到平台期。灵敏度达102个菌。

　　自左向右的扩增曲线为：107,106,105,104,103,102,101μl

　　图1   不同菌数的脆弱类杆菌标准株荧光定量PCR扩增图（略）

　　23   融解曲线（图2）   图2可见，主峰为特异的扩增产物，从105～10细菌含量的主峰峰值逐个降低，但位置一致；主峰前的小峰（79℃处）,可能是很少量的引物二聚体形成而致,并随细菌含量（模板量）降低，主峰与小峰的峰值差减小。

　　自上向下的峰线为105,104,103,102,101μl

　　图2   扩增产物的融解曲线（略）

　　3   讨论

　　本文结果显示，前引物序列831～864在脆弱类杆菌中完全互补，而与大肠埃希菌等互补序列不多；序列982～1007为脆弱类杆菌特有序列，其他细菌没有与之相对应的序列。荧光定量PCR表明，5株脆弱类杆菌有扩增产物，采用相同引物用rPCR扩增，在预计区域有扩增条带〔3〕，2种方法结果一致，可与大肠埃希菌、乳酸杆菌、嗜热链球相鉴别。本文受检菌菌数可低至102，与其他基本一致〔4〕。16S rRNA荧光定量PCR检测脆弱类杆菌，具有快速、敏感的特点，但在降低费用、商品化程度等方面应加以改进。

　　文献

　　〔1〕   苏维奇，纪迎春，姜岩.16S rRNA基因检测在临床细菌学鉴定中的应用［J］.世界感染杂志，2005，5（1）：79-80，83.

　　〔2〕   Erja Malinen,Anna Kassinen,Teemu Rinttil，et al.Comparison of real-timePCR with SYBR Green I or 5'-nuclease assays and dot-blot hybridization with rDNA-targeted oligonucleotide probes in quantification of selected faecal bacteria［J］.Microbiology,2003,149：269-277.

　　〔3〕   卞广林，罗予.16S rRNA PCR 鉴定脆弱类杆菌［J］.生物技术通讯,2006,17（1）：066-067.

　　〔4〕   沈永才，袁佩娜.16S rRNA 荧光PCR 法检测双歧杆菌［J］.微生态学杂志，2001,13（2）：66-69，72.