吉林省流行麻疹野病毒的核蛋白基因特征
【关键词】 麻疹
麻疹是由副粘病毒科麻疹病毒属的麻疹病毒引起的急性传染病〔1，2〕。研究发现，在麻疹病毒的6个结构基因中，除了血凝素蛋白(H)以外，核蛋白(N)的基因变化较大，其中N蛋白序列的羧基端450个核苷酸的区域属于高变区。为此，我们对麻疹病毒的核蛋白基因的分子生物学进行研究，为预测和控制麻疹的发生提供依据。
1 材料与方法
11 标本收集 2004年11月～2005年4月，在吉林省部分地区散发或暴发的麻疹疑似病例中采集标本，患者出疹3d内同时采集静脉血2ml(如有可能，出疹7～10d后再采集1份血)和咽拭子。咽拭子保存在2ml麻疹病毒标本运输液中(含有5%牛血清和终浓度含青霉素2000U/ml、链霉素200μl/ml和制霉菌素25U/ml的细胞培养液)。用于病毒分离的标本，-80℃保存。
12 病毒分离 将标本4℃过夜后取05ml接种于生长良好单层的CDW150细胞(又称Vero-SLAM细胞，具有麻疹病毒的细胞受体)，吸附60～120min后弃取上清，换含2%胎牛血清的胎牛血清培养液(DMEM)，培养7～10d，每天观察细胞培养液pH值和细胞病变(CPE)。必要时换液或盲传1代。细胞病变>75%时收获冻存。
13 病毒鉴定 用兔抗麻疹免疫血清对分离株作微量中和试验进行鉴定。兔抗麻疹免疫血清(长春生物制品研究所)。
14 麻疹IgM抗体测定 用酶联免疫吸附试验(ELISA)捕捉法检测病人血清中的麻疹IgM抗体，试剂盒(德国维润赛润生物试剂有限公司和北京贝尔生物工程公司)。
15 逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、序列测定和基因分型 采用酚-氯仿抽提液法提取麻疹病毒悬液中的病毒核糖核酸。参照美国疾病预防控制中心引物〔3〕。每次试验用去离子水作为阴性对照，扩增后的产物经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。逆转录酶和TaqDNA聚合酶(美国Biolab公司)。扩增后的PCR产物经纯化后，送上海生工生物技术服务有限公司完成测序工作。调出GenBank里的22个基因型代表株N基因羧基端450个碱基对序列，用Bio-Edit软件对这些代表株和本研究所分离到的17个毒株的N基因的450个碱基序列进行对比分析，确定基因分型。
2 结果
21 麻疹病毒的分离和鉴定 2004年11月～2005后4月，共收集经血清学确诊为麻疹暴发和散发病例标本103份，在CDW150细胞上接种，出现特殊的融合巨细胞病变，并能连续传代的17株(分别编为JL1～17)病毒经微量中和试验鉴定均为麻疹病毒。在79份暴发病例标本中分离到14株麻疹病毒，检出率为1772%；24份散发病例标本中分离到3株麻疹病毒，检出率为125%。
22 序列分析和基因分型(图1) 对17株麻疹病毒进行了序列测定和基因分型，并对N基因羧基端450个核苷酸序列与22个已知基因型株的对应序列做基因亲缘性分析，结果均为H1基因型。H1基因型是麻疹病毒型内变异最大的基因型。本研究中的17株H1基因型病毒进一步分为H1a13株、H1b4株。从暴发病例分离的病毒中有11株H1a亚型和3株H1b亚型，散发病例分离的病毒中有2株H1a亚型和1株H1b亚型。H1a和H1b在450个核苷酸片段中的差异为205%～471%，H1a亚型内病毒之间变异最大为13个碱基对，而H1b亚型仅有7个碱基对。
图1 吉林省麻疹野病毒株与株的核蛋白基因亲缘性关系树（略）
3 讨论
麻疹病毒是单一血清型，一直被认为病毒变异较少、相对稳定。但从20世纪80年代以来，发现一些国家从界分离的麻疹病毒的血凝素(HA)蛋白和N基因发生了较大的变异，与经典的Edmonston株比较有差异，与现行的疫苗株有所不同〔4，5〕。从标本中分离麻疹病毒由于受诸多条件的影响，成功率不高。通过实验发现，麻疹病毒分离成功与否，除要求生长良好的敏感细胞、保证标本低温运输保存和操作条件外，主要取决于采样时间的早晚。麻疹在发病初期因症状与感冒相似常被忽视，往往在出现皮疹后才做出诊断，但此时机体内已开始产生麻疹的IgM抗体，且滴度迅速上升，使麻疹病毒排毒期在短期内结束。因此，要成功分离出麻疹病毒所使用的标本最好在出疹4d内采集。1998年WHO发表了依据麻疹病毒的基因特征进行病毒分类及基因型命名的标准，2001年又进行了补充。标准规定对麻疹病毒基因定型至少要对HA全长编码序列或N基因羧基端450个核苷酸序列进行分析，并将麻疹病毒划分为8个基因组(Genetic group)共22个基因型(Genotype)，它们分别是A、B(B1～3)、C(C1、C2)、D(D1～9)、E、F、G(G1～3)和H(H1、H2)，其中D1、E、F和G1已超过10年未发现流行〔6〕。依据目前全球疾病发生流行趋势，仍将它们列入序列分析的对照株中。通过对已分离的17株麻疹病毒N基因羧基端450个核苷酸序列分析证实，全部是H1基因型。与相关报道的麻疹野病毒优势流行株基因型相同〔7〕。说明H1基因型是吉林省麻疹病毒的优势流行株，是导致吉林省麻疹局部暴发和散发的主要病原体。
参考文献
〔1〕 黄祯祥，洪涛，刘崇柏.医学病毒学基础及实验技术［M］.北京：出版社，1990：753-755.
〔2〕 李凡.病原生物学［M］.北京：中国协和医科大学出版社，2004：193-195.
〔3〕 Rota PA.RNA extraction and reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR).Standard protocols for molecular epidemiology measles section［EB］.CDC,2002.Available from:http://www.cdc.gov/.
〔4〕 许文波，朱贞，张珍英，等.麻疹野病毒H1基因型在中国流行的分析［J］.中国计划免疫，2003，9(1)：1-8.
〔5〕 Xu W,Tamin A,Rota JS,et al.New genetic group of measles viruses isolated in the People's Republic of China［J］.Virus Res,1998,54:147-156.
〔6〕 谢正德，朱贞，许文波，等.北京流行的麻疹野病毒的核蛋白基因特点［J］.中国计划免疫，2002，8：191-195.
〔7〕 张燕，许文波，朱贞，等.中国2003年流行的麻疹野病毒分子流行病学分析［J］.中国计划免疫，2005，6：165-174.
